辣椒CaNPR1-RNAi表达载体的 构建及其对辣椒的转化

从辣椒中克隆到一个与拟南芥系统获得抗性正调节基因NPR1同源的CaNPR1基因的全长cDNA。辣椒CaNPR1基因与拟南芥NPR1基因在mRNA水平上同源性为62.9%,两者的编码产物一致性为49·7%,相似性为65.7%。为鉴定该基因的功能,构建了一个以CaNPR1基因为靶基因的RNA干涉辣椒表达载体pCaNPR1-RNAi,并用根癌农杆菌介导法转化辣椒桂研五号,共获得了6株卡那霉素抗性再生苗,经Southern杂交证实,这些再生苗均为转基因植株,为进一步鉴定该基因的功能奠定了基础。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株wxcA基因与EPS的产量有关

在以前的工作中,采用转座子Tn5gusA5对野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xcc) 8004菌株进行诱变,获得一批胞外多糖(EPS)合成减少的突变体,对这些突变体的Tn5gusA5的插入位点进行分析后,发现有两株突变体是wxcA基因不同插入位点的突变体。以前认为wxcA基因与脂多糖(LPS)的O抗原合成有关而与EPS的合成无关。为明确wxcA基因的功能,对8004菌株的wxcA基因进行缺失,获得的ΔwxcA突变体的EPS产量与野生型菌株相比,减少了50%,并且一段PCR合成的包含wxcA基因的DNA片段能反式互补ΔwxcA突变体,恢复突变体的EPS产量。这证实了8004菌株的wxcA基因与EPS的合成产量有关。     

水稻白叶枯病菌广西分离株K74中主效TAL效应物的鉴定

水稻是世界上主要的粮食作物之一。水稻白叶枯病(Bacterial leaf blight)是危害水稻最严重的细菌性病害,可使水稻减产20%以上,严重时甚至绝产,给农业生产和经济造成巨大影响。水稻白叶枯病由水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)的侵染造成,而TAL效应物是Xoo的重要致病因子。近年来,该病在广西也有多发的趋势。2007年从防城港疫区分离得到Xoo K74菌株,经前期研究表明该菌株中有18个tal基因。本研究中,我们对K74菌株中的TAL效应物进行了功能研究。通过基因同源整合突变及互补等研究,我们鉴定到了K74菌株一个与致病力相关的主效TAL效应物。     

堆肥宏基因组柯斯质粒文库的构建和DNA提取技术的改进

堆肥环境中高浓度腐殖酸的存在阻碍了对这个环境中的未培养微生物的宏基因组研究。我们提出了一个确实可行的提取堆肥环境DNA的方法, 这个方法通过使用Sephadex G200＋酸洗PVPP层析柱与电洗脱两步纯化的方法成功地纯化堆肥环境来源的DNA, 用这个DNA成功构建了一个包含约10万个克隆的柯斯质粒文库。从这个文库中筛选到一个新的β-葡萄糖苷酶基因。针对文库低的阳性筛选率问题, 利用分子技术研究了不同的分离速度对提取到的总DNA中真核生物DNA量的影响, 以减少文库中真核生物DNA的污染。     

大肠杆菌转录后调控蛋白CsrA的C末端具有抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性的功能

CsrA(在有些细菌例如十字花科黒腐病菌中也称为RsmA,统称CsrA/RsmA)是一类在细菌中广泛分布而且氨基酸序列非常保守的RNA结合蛋白。研究表明,CsrA/RsmA作为转录后全局调控因子参与了包括细胞碳代谢、次生代谢、运动性、生物被膜形成以及动植物病原菌的致病过程等许多细胞过程的调控。CsrA/RsmA在不同的细菌中的生物学功能各有异同。在大肠杆菌中,CsrA的主要功能是控制细胞的碳代谢、运动性和生物被膜形成;而在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,Xcc)中,CsrA的同源蛋白RsmA的主要功能除了控制碳代谢、运动性和生物被膜形成外,还控制致病性和胞外酶的产生。大肠杆菌的CsrA(CsrAE.coli)是否具有XccRsmA(RsmAXcc)的功能?为了回答这个问题,我们用大肠杆菌的csrA基因(csrAE.coli)互补Xcc的rsmA基因(rsmAXcc)的缺失突变体DM2506。结果显示,csrAE.coli能够互补DM2506的所有表型,说明CsrAE.coli具有RsmAXcc的全部功能。更重要的是,我们发现,无论是rsmAXcc突变体还是野生型菌株,导入表达CsrAE.coli的质粒后均导致其致胞外蛋白酶活性的严重下降,证明CsrAE.coli具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的作用。进一步的实验证实,CsrAE.coli的C末端第53～61位氨基酸残基具有抑制Xcc胞外蛋白酶活性的功能。     

十字花科黑腐病菌中影响致病相关基因XC3814表达的基因鉴定

十字花科黑腐病菌8004菌株的XC3814基因与致病性和胞外多糖合成有关。文章将XC3814的启动子与报告基因sacB融合, 构建了XC3814的表达报告质粒pL3814sac。将该质粒导入野生型菌株8004, 获得了报告菌株8004/pL3814sac。利用转座子EZ::Tn5对报告菌株的基因组进行随机诱变, 分离到3株耐蔗糖的突变体。分析发现其中的1株突变体是由EZ::Tn5插入到编号为XC3882的未知功能的基因所产生的。将由XC3814启动子与报告基因gusA融合得到的报告质粒pGUS3814分别导入8004菌株和XC3882的转座子Tn5gusA5插入突变体, 测定比较pGUS3814的GUS表达水平, 结果显示在XC3882突变体背景下GUS的表达水平比在野生型背景下降低81.3%, 表明XC3814基因的表达水平受XC3882基因的影响。     

野油菜黄单胞菌野油菜致病型胞外多糖合成有关的DNA序列的克隆

以从野油菜黄单胞菌野油菜致病型（Xanthomonascampestrispv.campestris）胞外多糖突变体T117中克隆到的含有突变序列的DNA片段作探针,从野生型菌株中鉴定和克隆了含有相应序列的9．4kbHindⅢ片段。该片段可反式互补突变体T117,完全恢复其胞外多糖的合成,说明该片段至少含有一个完整的与该菌胞外多糖合成有关的基因。     

大肠杆菌全局调控蛋白CsrA中抑制十字花科黑腐病菌胞外蛋白酶活性所必需的氨基酸残基的鉴定

CsrA/RsmA蛋白家族是细菌中一类重要的转录后全局调控因子,它们调控细菌的碳代谢、次生代谢、运动、生物被膜形成以及致病等过程。CsrA/RsmA蛋白家族通常由60~72个氨基酸基组成,其中第1至第52位氨基酸高度保守,而第53位以后的氨基酸则高度可变。目前人们认为其氨基酸高度保守性是不同种属细菌CsrA/RsmA功能和作用机理相似的基础,但是其高度可变区与不同种属CsrA/RsmA蛋白功能差异的关系尚不清楚。我们之前的研究显示,大肠杆菌(Escherichia coli)的CsrA(CsrAE.coli)蛋白的高度可变区(第53至第61位氨基酸残基)具有强烈的抑制十字花科黒腐病菌(Xanthomonas campestris pathovar campestris,简称Xcc)胞外蛋白酶活性的能力。本研究中,我们采用丙氨酸置换方法,确定了CsrAE. coli可变区中抑制Xcc胞外蛋白酶活性必需的氨基酸残基。结果显示,CsrAE. coli蛋白的第54位赖氨酸(K54)、第60位丝氨酸(S60)和第61位酪氨酸(Y61)置换成丙氨酸后,CsrAE. coli蛋白丧失了抑制Xcc胞外蛋白酶活性的能力;而其它位点的丙氨酸置换不影响其抑制Xcc胞外蛋白酶活性的能力。这个结果证明K54、S60和Y61是CsrAE. coli抑制Xcc胞外蛋白酶活性所必需的,为揭示大肠杆菌的CsrA E.coli蛋白抑制Xcc胞外蛋白酶活性的分子机理奠定基础。     

水牛瘤胃宏基因组的一个新的b-葡萄糖苷酶基因umcel3G的克隆、表达及其表达产物的酶学特性

以木质纤维素为原料、应用同步糖化共发酵工艺发酵生产酒精时需要酸性中低温高活力纤维素酶包括b-葡萄糖苷酶。本工作分6次构建了水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库, 获得1.26×105个克隆, 文库含外源DNA的总长度 约为4.8×106 kb。从文库中筛选到118个表达b-葡萄糖苷酶活性的独立克隆。发现其中8个克隆表达的b-葡萄糖苷酶在pH5.0、37oC条件下活性较强。对其中一个克隆进行了亚克隆, 序列分析发现一个2223 bp的潜在的编码b-葡萄糖苷酶基因(umcel3G)的开放阅读框(ORF), 其编码产物的氨基酸序列与来自于 Bacillus sp.的一个b-葡萄糖苷酶同源性最高, 具有60%的一致性和73%的相似性。该ORF在E.coli中的表达产物Umcel3G的分子量与预测大小相似, 酶谱分析表明该表达产物具有b-葡萄糖苷酶活性, 证实该基因为一个b-葡萄糖苷酶基因。测定了用Ni-NTA纯化的Umcel3G的酶学特性, 其最适pH和最适温度分别为6.0~6.5和45oC。一些金属离子如Ca2+、Zn2+能显著提高该酶的酶活, 而另外一些金属离子如Fe3+、Cu2+能抑制Umcel3G的活性。在pH4.5、35oC和5 mmol/L的 Ca2+存在的条件下, 用Ni-NTA纯化的重组酶的比活为22.8 IU/mg, 说明该酶在用SSCF工艺发酵生产酒精中有潜在的应用价值。