利用长距离PCR扩增国内肠道病毒流行株基因组方法的建立和评价

目的:通过调查近年来我国肠道病毒EV-71型和柯萨奇病毒A16型流行株的全基因组序列,建立一种能够获得我国肠道病毒序列的通用扩增方法,为今后的手足口病流行病学分析、致病机理研究等打下基础。方法:收集我国近5年各地报道的肠道病毒流行株全基因组序列作为参考序列进行比对分析,在保守区设计通用引物,利用3'RACE、长距离PCR扩增及简并引物扩增肠道病毒全基因组序列,采用IonTorrentPGM二代测序仪对扩增产物进行深度测序,以对扩增方法进行验证和评价。结果:通过比对肠道病毒流行株序列设计了通用扩增引物,经二代测序实验获得了肠道病毒全基因组序列;以系列比例模拟混合病毒感染,该扩增方法能够同时获得2株肠道病毒的全基因组序列;能够完整地揭示肠道病毒重组情况。结论:建立了针对我国近年来肠道病毒流行株的通用全基因组扩增方法,在病毒培养液中肠道病毒的提取与扩增中显示了较高的灵敏度,能够反映混合病毒感染、重组病毒的情况。     

copGFP和PuroR双标记基因慢病毒融合表达载体的构建及应用*

目的: 构建具有绿色荧光蛋白(copGFP)和嘌呤霉素抗性基因(PuroR)融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体,检测其嘌呤霉素抗性和绿色荧光蛋白表达的特性。方法: 从pCDH-CMV-MCS-copGFP载体中扩增copGFP编码区DNA序列,从pLKO.1载体中扩增Puro^R编码区DNA序列,运用重组PCR方法,扩增copGFP与Puro^R基因融合编码序列并克隆至经BamH Ⅰ+Sal Ⅰ双酶切的pCDH-CMV-MCS-copGFP载体片段中,构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体;载体的融合标签序列进行测序确证;将该载体用辅助包装质粒PLP1、PLP2、VSVG在293T细胞中包装成慢病毒后感染肝癌细胞MHCC97H,检测感染细胞对嘌呤霉素的抵抗作用以及绿色荧光蛋白的表达情况;为验证该载体表达外源目的基因的有效性,将Sp1编码区DNA序列插入该载体中包装成慢病毒,用对照及表达Sp1的慢病毒感染肝癌细胞MHCC97H,感染细胞经1 mg/ml嘌呤霉素筛选7 d后获得稳定感染细胞株,提取稳定感染细胞的总RNA及总蛋白,分别运用RT-qPCR和Western blot方法检测Sp1在对照及表达Sp1的慢病毒感染的肝癌MHCC97H细胞中的mRNA和蛋白表达水平的差异。结果: 成功构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体;该载体与辅助质粒包装出的慢病毒感染肝癌细胞后,感染细胞同时具有嘌呤霉素抗性和表达绿色荧光蛋白特性;将Sp1编码序列插入该载体,包装慢病毒并肝癌细胞,Sp1 的mRNA水平对照细胞相比分别升高3.3倍,蛋白水平升高2.2倍(P＜0.01)。 结论: 成功构建含copGFP和Puro^R融合表达双筛选标记的慢病毒过表达载体,该载体编码的融合双标记基因具有嘌呤霉素抗性和绿色荧光蛋白表达的特性,可高水平表达长片段的目的基因。     

基于Image J软件的裸鼠肝脏原位肿瘤图像定量分析方法

目的:采用门静脉注射肝细胞癌细胞的方法,能够在裸鼠肝脏形成多发与弥散的肿瘤病灶,进而模拟进展期肝细胞癌的转移与侵袭性生长。本研究旨在建立基于图像分析软件Image J的裸鼠肝脏原位肿瘤图像定量分析方法。方法:培养高侵袭性的人肝细胞癌细胞系MHCC97-H,通过肝门静脉注射的方法,将MHCC97-H细胞接种于裸鼠肝脏,经2~4周生长,MHCC97-H细胞能够在裸鼠肝脏形成多发与弥散的肿瘤病灶;收集动物获得肝脏脏器进行拍照,对所得图片进行分析;用Image J软件对图像进行定量分析,分别确定整体肝脏脏器的面积与肿瘤病灶的面积,二者之比即可反映出肝细胞癌在裸鼠肝脏形成肿瘤病灶占肝脏脏器的面积比例;在此基础上,对接种有肝细胞癌细胞的裸鼠,行灌胃给药,给予2 mg/kg剂量的分子靶向药物索拉非尼进行治疗,分别确定对照组与治疗组肝脏形成的肿瘤病灶并进行定量分析,可依据此计算索拉非尼治疗对肿瘤病灶的抑制率。结果:MHCC97-H细胞接种能够在裸鼠肝脏形成多发与弥散的肿瘤病灶,用Image J软件可准确圈出肝脏脏器上的肿瘤病灶,确定病灶占肝脏脏器的面积比例。利用本研究的方法能够定量分析索拉非尼对MHCC97-H细胞形成多发、弥散病灶的抑制作用。结论:建立了基于图像分析软件Image J的裸鼠肝脏原位肿瘤图像定量分析方法,对抗肿瘤药物活性评价相关研究具有重要意义。