miR-195通过靶向调控趋化因子5促进胃癌细胞增殖、转移及侵袭的实验研究

目的:研究miR-195通过靶向调控趋化因子5促进胃癌细胞增殖、转移及侵袭的分子机制。方法:选取MGC803及NCI-N87细胞,根据转染不同分为:miR-NC组(空质粒),miR-195-mimics组(模拟序列)。实时荧光定量PCR法检测miR-195表达;MTT检测细胞增殖能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭力;细胞划痕实验检测细胞转移能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot检测chemokine 5表达水平;Spearman相关分析miR-195及chemokine 5相关性。荧光素酶实验验证miR-195与chemokine 5的靶向关系。结果:miR-195-mimics组细胞miR-195水平高于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组第1、2、3、4 d细胞活力低于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组G1细胞高于miR-NC组,G2期、S期细胞低于miR-NC组,G2/S期细胞比值低于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组划痕距离大于miR-NC组(P0.05);miR-195 mimics组细胞侵袭数低于miR-NC组(P0.05);miR-195-mimics组细chemokine 5蛋白含量低于miR-NC组(P0.05);miR-195 m RNA水平与chemokine 5蛋白含量负相关(r=-0.398,P=0.00);miR-195可直接靶向chemokine 5。结论:miR-195可通过靶向chemokine 5促进胃癌MGC803及NCI-N87细胞的增殖、转移及侵袭。     

腹腔镜辅助胃癌D2根治术联合胃背侧系膜近胃端完整系膜切除术对进展期胃癌患者肠黏膜屏障功能和腹腔微转移的影响

摘要 目的：探讨腹腔镜辅助胃癌D2根治术联合胃背侧系膜近胃端完整系膜切除术对进展期胃癌（AGC）患者肠黏膜屏障功能和腹腔微转移的影响。方法：选取2016年12月～2018年12月我院收治的105例AGC患者,按随机数字表法分为对照组（n=52）和实验组（n=53）,分别施行腹腔镜辅助胃癌D2根治术、腹腔镜辅助胃癌D2根治术联合胃背侧系膜近胃端完整系膜切除术。观察两组手术情况（淋巴结清扫数量、手术时间、术中出血量、近切缘距离）、胃肠功能恢复指标（肛门排气时间、经口进食时间、肠鸣音恢复时间）、并发症、住院时间及术前、术后1 d、3 d、7 d肠黏膜屏障功能[尿乳果糖/甘露醇（L/M）、血清二胺氧化酶（DAO）]、气腹后、关腹前腹腔微转移指标[多巴胺脱羧酶（DDC）、癌胚抗原（CEA）],并于术后12个月随访两组复发率。结果：实验组术中出血量少于对照组（P＜0.05）;两组经口进食时间、肛门排气时间、住院时间、肠鸣音恢复时间比较无差异（P＞0.05）;术前、术后1 d、3 d、7 d两组血清DAO水平、尿L/M比较无差异（P＞0.05）;关腹前实验组腹腔冲洗液DDC、CEA水平低于对照组（P＜0.05）;两组并发症总发生率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）;术后12个月随访,实验组和对照组各失访2例,实验组复发率3.92%（2/51）低于对照组20.00%（10/50）（P＜0.05）。结论：腹腔镜辅助胃癌D2根治术联合胃背侧系膜近胃端完整系膜切除术治疗AGC,能有效降低术中出血量,恢复胃肠功能,减少腹腔微转移及术后复发,且未增加肠黏膜屏障功能损伤,安全性高。     

人PINK1-shRNA载体的构建及对神经母细胞瘤细胞线粒体的影响

摘要 目的：构建筛选人源靶向特异PINK1-shRNA敲减质粒,转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞并验证该质粒转染后对PINK1基因的敲减效率,观察对细胞线粒体形态的影响。方法：构建两对人源PINK1-shRNA序列(编号分别为PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42),将这2对干扰序列连接在载体上形成重组载体,经测序验证后,将空载体和两对敲减质粒分别转染SH-SY5Y细胞,获得基因敲减的细胞模型,用CCK-8法检测细胞的存活率,用荧光定量PCR方法确定PINK1基因的敲减效率,用蛋白质免疫印迹法验证细胞内PINK1的表达水平是否发生改变,用激光共聚焦显微镜观察线粒体的形态是否发生了改变。结果：我们提取的质粒,经测序结果显示,质粒载体构建成功;转染细胞后,CCK-8 法检测细胞存活率发生了降低,与正常组比较,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒组,细胞的存活率分别降低了13.7%（P＜0.05）和14.1%（P＜0.05）;荧光定量PCR结果显示,与正常组相比,PINK1-shRNA-39组和PINK1-shRNA-42组敲减质粒转染的细胞内PINK1基因的表达分别降低了24.1%（P＜0.01）和36.7%（P＜0.01）;蛋白质印迹法结果显示,与正常组相比,两对质粒分别转染细胞后,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平降低,差异有统计学意义(P＜0.01),PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平有效降低更明显;与正常组比较,激光共聚焦显微镜观察到基因敲减两组细胞的线粒体部分发生断裂,碎片较多,基因敲减两组的线粒体的形态因子显著降低,差异有统计学意义（P＜ 0.01）。结论：成功构建了人源的PINK1基因敲减的质粒,并将敲减的质粒成功转染至SH-SY5Y 细胞中,细胞内PINK1基因的mRNA和蛋白的表达水平降低,且细胞线粒体的形态发生了改变。     

微小RNA(microRNA)在肝细胞肝癌发生发展中的作用研究进展

MicroRNA是近几年发现的一种非编码小分子RNA,其主要功能体现在参与调节生物个体发育、细胞增殖与分化、肿瘤细胞的发生等多种病理过程中。MicroRNA在调控癌基因和抑癌基因的表达过程中,以及在肝细胞肝癌发生和发展中发挥着关键性的作用。本综述对microRNA在肝细胞肝癌发生发展中的作用进行汇总,以期为肝细胞肝癌的临床诊断以及治疗提供理论参考。     

构建基于CRISPR/Cas9技术敲除ALOX5的质粒

旨在利用CRISPR/Cas9技术构建敲除花生四烯5-脂氧合酶基因(Arachidonate 5-lipoxygenase gene,ALOX5)的重组质粒。设计合成3对靶向敲除ALOX5第六外显子的sgRNA,将其分别插入到CRISPR/Cas9质粒骨架pX458载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α后挑取克隆,通过测序评估重组质粒是否构建成功。将构建好的重组质粒转染293T细胞,在荧光显微镜下观察转染效果,挑取转染成功的细胞,用试剂盒提取转染细胞基因组DNA,PCR扩增含敲除位点的DNA片段,用测序技术获得核苷酸序列,用DNAStar软件分析转染细胞中ALOX5基因敲除情况。测序结果表明2对双链sgRNA寡核苷酸已插入质粒,且序列正确,靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5构建成功。其在293T细胞中的转染效率约为50%,用一代测序法未检测到sgRNAs的切割效果。初步表明利用CRISPR/Cas9技术成功构建靶向ALOX5基因的重组质粒pX458-sgRNAs-ALOX5。     

生态系统服务功能与景观格局耦合协调度研究——以武陵山区退耕还林工程为例

生态系统服务功能与景观格局演变关系极为密切,研究生态系统服务功能与景观格局的耦合协调度对于区域发展具有重要意义。以武陵山区退耕还林工程为例,参照国家标准和行业标准,采用分布式测算方法、景观格局指数分析和耦合协调度模型等方法,旨在揭示武陵山区退耕还林工程生态系统服务功能与景观格局二者耦合协调关系。结果表明:(1)2005—2017年间武陵山区退耕还林工程各项生态服务功能物质量均以15倍左右速度增长,生态系统服务空间分布格局最佳区域由西部地区逐渐向东南扩大;(2)武陵山区景观演变存在时空差异,1995—2005年景观格局变化更为明显,变化区域集中在中西部地区,2005—2015年与之相比,景观格局变化空间上更为分散;(3)武陵山区退耕还林工程生态系统服务与景观格局演变存在较高水平的耦合以及高水平的协调性。研究结果可为武陵山区土地利用规划及退耕还林工程进一步实施提供科学依据。     

产NDM-5大肠埃希菌的鉴定及特征分析

对分离自血液标本的1株碳青霉烯类耐药大肠埃希菌(Escherichia coli)SCNJ06进行特征分析,以期为临床耐药菌株感染的防治提供理论参考。采用全基因组测序以及生物信息学分析,该菌株属于序列型167(ST167),含有11种耐药基因,分别是rmtB、aph(3″)-Ib、aph(6)-Id、bla_(NDM-5)、bla_(TEM-1B)、bla_(CTX-M-55)、fosA3、floR、sul2、tet(A)和mdf(A)。其中,bla_(NDM-5)位于IncX3型质粒pNDM5_SCNJ06上,mdf(A)位于染色体上,其余耐药基因位于IncFII型质粒prmtB_SCNJ06上。接合试验显示,pNDM5_SCNJ06和prmtB_SCNJ06均能够发生接合转移。应加强抗菌药物临床应用管理和医院感染防控措施,重视细菌耐药监测工作。     

表观遗传的化学干预对金龟子绿僵菌次生代谢产物影响的研究

[背景] 表观遗传酶类化学抑制剂对真菌的影响研究主要集中在新次生代谢产物挖掘方面,而对大量已知次生代谢物含量的变化却关注较少。金龟子绿僵菌是一种常用杀虫真菌,能代谢出多种已知生物活性物质,其含量可能会影响到该菌与环境间关系及利用潜力。[目的] 评估组蛋白去乙酰化酶和DNA甲基转移酶的化学抑制剂对金龟子绿僵菌代谢物安全性和可利用性的影响。[方法] 在金龟子绿僵菌培养基中添加表观遗传酶类化学抑制剂,培养一定时间后用高分辨液质联用及标准品对照方法分析次生代谢产物变化。根据差异代谢物的生物活性评估化学抑制剂的影响。[结果] 高分辨液质联用分析结果表明当抑制剂浓度达500μmol/L时,金龟子绿僵菌有16种主要次生代谢产物出现明显量的变化,包括destruxin A、A1、A2、B、B1、B2、E、E2、Ed、didesmethyldestruxin C、dihydrodestruxin A、desmethyldestruxin B、12-hydroxyovalicin、subglutinol C、fungerin和ustilagic Acid C。其中,丁酸钠处理可使15种主要代谢物含量升高。苯甲酰胺可使12种主要代谢物含量升高。伏立诺他虽然仅能使10种主要代谢物含量升高,但部分代谢物的升高幅度明显高于前两者。2种DNA甲基转移酶抑制剂可使金龟子绿僵菌代谢物中绿僵菌素类代谢物含量普遍下降。[结论] 组蛋白去乙酰化酶抑制剂可引起金龟子绿僵菌主要代谢物含量普遍升高,而DNA甲基转移酶抑制剂使金龟子绿僵菌的绿僵菌素含量普遍下降。由于变化的代谢物都具有显著的杀虫、免疫抑制或抗菌抗癌等生物活性,因此上述化学抑制剂可增强或降低金龟子绿僵菌对环境中昆虫毒性,同时也增加或降低其代谢物利用潜力。另外,subglutinol C、fungerin和ustilagic Acid C是首次在金龟子绿僵菌中被发现。     

奇异变形杆菌中基因岛介导的多重耐药传播研究进展

奇异变形杆菌是导致医院内感染的重要条件致病菌,广泛分布于自然环境及人和动物的肠道中。基因岛是细菌染色体上约10-200 kb独立的DNA片段,能促进宿主细菌适应复杂多变的环境,与细菌适应性进化密切相关。近年来在奇异变形杆菌基因组中发现了多个与多重耐药密切相关的基因岛,包括沙门菌基因岛1及其相关基因岛、SXT/R391整合性接合元件、PmGRI1等,表明基因岛在奇异变形杆菌多重耐药形成和传播中具有重要作用。本文对奇异变形杆菌中与耐药相关基因岛的结构特征、传播机制、流行情况等进行综述,以期为奇异变形杆菌中多重耐药相关基因岛的深入研究提供参考。     

GJA1在结直肠癌组织中表达及促进侵袭转移的研究

摘要 目的：间隙连接Alpha-1蛋白（Gap Junction Alpha-1,GJA1）是间隙连接中分布最广泛的蛋白,并在多种肿瘤中起促癌作用,但其在结直肠癌发生、发展的作用研究甚少。本实验旨在探究GJA1在结直肠癌组织中的表达情况及其对结直肠癌细胞系侵袭、转移能力的影响,以期为结直肠癌的诊断和预后寻找新的生物标志物。方法：收集92对结直肠癌及其癌旁组织样本,提取组织RNA,利用qRT-PCR检测GJA1相对表达量,并分析GJA1表达与临床病理特征及预后的相关性。在HCT116和HCT8两种结直肠癌细胞系中分别构建GJA1过表达载体和敲减载体,利用qRT-PCR和、Western Blot检测上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）相关蛋白E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和Snail的表达变化,利用Wound healing和Transwell实验观察其迁移、侵袭能力的变化。结果：相对于癌旁组织,GJA1在结直肠癌组织中显著低表达。并且结直肠癌中低表达的GJA1与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴血管转移相关,低表达GJA1结直肠癌患者显示更差的总体生存率和更低的无病生存率。此外,过表达GJA1后,结直肠癌细胞E-cadherin的表达升高,N-cadherin、Vimentin和Snail的表达降低,划痕愈合减慢,Transwell转移细胞减少;而敲减GJA1后,结直肠癌细胞E-Cadherin的表达降低,N-Cadherin、Vimentin和Snail的表达升高,划痕愈合加快,Transwell转移细胞增多。结论：GJA1在结直肠癌中低表达,其表达降低可通过EMT促进结直肠癌的侵袭、转移并影响病人预后。