黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表达

将黑曲霉葡萄糖氧化酶(GOD)基因重组进大肠杆菌酵母穿梭质粒Ppic9,转化甲基营养酵母Pichia pastoris GS115,构建出GOD的高产酵母工程菌株。在酵母αFactor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,黑曲霉GOD在甲基酵母中大量表达并分泌至胞外,经甲醇诱导3～4d,发酵液中的GOD活力可达30～40u/mL。SDS-PAGE证实GOD在培养物上清中的含量显著高于其它杂蛋白,约占胞外蛋白总量的60%～70%,经Q SepharoseTMFast Flow离子交换柱一步纯化即达电泳纯。重组酵母GOD比活达426.63u/mg蛋白,是商品黑曲霉GOD的1.6倍。动力学性质分析表明,重组酵母GOD的K_m和K_cat分别为38.25mmol/L和3492.66s-1,与商品黑曲霉GOD相比,具有更高的催化效率。重组酵母GOD的高活力特性可有效提高葡萄糖传感器的线性检测范围。     

烷基胺玻璃固定化葡萄糖氧化酶测定血糖

定量分析血糖在门诊和许多疾病如糖尿病,甲状腺机能抗进,粘液腺癌．垂体机能减退。肾上腺机能减退和妨碍葡萄糖吸收等疾病的诊断有重要意义。测定葡萄糖有很多方法,采用葡萄糖氧化酶比色法,由于操作简便．专一性强,灵敏度高,因此比较适合用于常规测定⑴。但是葡萄糖氧化酶的价格高。把酶固定在不溶于水的支持物上,酶可以重复使用,因此可以降低成本。虽然葡萄糖氧化酶固定在烷基胺玻璃上。在连续流动系统中测定葡萄糖,但烷基胺固定的酶还没有用来测定血糖。一般来说．烷基胺玻璃抗微生物的腐蚀。有很广的pH适应性和不同溶剂如乙醇和丙酮的稳定性。本文报道利用烷基胺玻璃珠固定葡萄糖氧化酶常规分析血糖。     

酶蛋白结构稳定性对商品酶电极影响的研究

研究了不同商品来源的葡萄糖氧化酶对商品酶电极制作和生产的影响,酶蛋白分子结构及导电小分子材料的选择对碳电极表面电子传递的作用,商品酶的稳定剂对分子导电体进入生物氧化还原酶活中心的阻碍作用,讨论了规模化生产商品酶电极的方式。     

酶和发酵工程

<正>851847利用气相一液相色谱法测定乳酸细菌生长的最终产物〔英〕/Thornhill PJ.…//Appl.Environ.Mierobiol-1984,47(6)-1250-1254〔译自DBA 1984,3(17),84-08038〕报道了一种简单的气-液色谱法用于测定发酵液中的乙醇、醋酸、     

生物传感器的开发和应用进展

生物传感器的开发和应用进展冯德荣（山东省科学院生物研究所２５００１４）一、生物传感器的特点和原理在生物技术领域迫切需要建立的各种快速分析和优化控制方法中,生物传感器是目前最受到人们注意的一种。生物传感器能对许多过去难于测定的生化物质进行定量分析,已经在实践中开始应用的生物传感器都是固定化酶酶电极,包括葡萄糖、谷氨酸、乳酸、乙醇等多种。     

采用混合策略提高葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的表达水平

为了提高葡萄糖氧化酶 (GOD) 在毕赤酵母中的表达水平,提出了甲醇/山梨醇混合碳源诱导和共表达分子伴侣二硫键异构酶 (PDI) 和透明颤菌血红蛋白 (VHb) 两种策略。利用对照菌株X33/pPIC9k–GOD 在5 L发酵罐放大培养时,采用甲醇/山梨醇混合碳源诱导,GOD最终酶活为456 U/mL,比只采用甲醇作为单一碳源诱导时GOD最终酶活提高了20%。利用整合伴侣蛋白菌株X33/pPIC9k-GOD/pPICZ-PDI-VHb在5 L发酵罐进行高密度发酵,采用甲醇/山梨醇混合碳源诱导,GOD最终酶活达到716 U/mL,蛋白浓度为7.4 g/L。研究结果对提高外源蛋白在毕赤酵母中的表达有重要参考价值。     

固定化原生质体生产葡萄糖氧化酶*

用溶壁酶处理对数生长前期的黑曲霉GP 024细胞,分离得到原生质体,再用光交联树脂包埋制备固定化原生质体,用于生产葡萄糖氧化酶。其胞外葡萄糖氧化酶的比产率几乎达到相应的游离细胞生产的胞内和胞外全部葡萄糖氧化酶的比产率。用光交联树脂制备的固定化黑曲霉细胞的产酶特性与游离细胞相似,而用溶壁酶处理过的固定化细胞的产酶特性与固定化原生质体相似。