肺泡Ⅱ型上皮细胞自噬体与结核分枝杆菌相互作用的研究

目的:检测LC3在肺泡Ⅱ型上皮细胞A549上的表达情况,及结核分枝杆菌刺激后对其表达的影响,探讨自噬在结核分枝杆菌感染上皮细胞中所起的作用。方法:体外培养肺泡Ⅱ型上皮细胞A549,在结核分枝杆菌感染A549细胞0h,24h分别提取RNA,采用RT-PCR的方法检测LC3mRNA的表达情况。采用凋亡坏死染色试剂盒在结核分枝杆菌感染24h后检测对照组,3-MA组,MTB组和3-MA+MTB组的细胞坏死情况。在结核分枝杆菌感染A549细胞4h,8h,16,24h采用Non-Radioactive Cytocity Assay的方法检测对照组,3-MA组,MTB组和3-MA+MTB组上清液LDH的OD值。结果:LC3在肺泡Ⅱ型上皮细胞显著表达,结核分枝杆菌感染后LC3表达降低。细胞凋亡和坏死染色结果显示空白组和3-MA组没有明显差异(P>0.05),MTB组和3-MA+MTB组有明显差异(P<0.05)。LDH检测显示MTB组和3-MA+MTB组上清液LDH的OD值数据两两之间有明显差异(P<0.05)并且有时间依赖性。结论:肺泡II型上皮细胞自噬体在抵抗结核分枝杆菌的感染过程中起一定的作用。     

与成纤维细胞共培养的肺泡II型上皮细胞的生物学特性

建立胎鼠肺泡II型上皮细胞(AECII)与肺成纤维细胞(LF)共培养模型,观察与LF共培养下AECII的生物学特性。倒置相差显微镜观察AECII形态和基本生长情况;RT-PCR和流式细胞术分别检测肺泡表面活性蛋白-C(SP-C)、水通道蛋白5(AQP5)mRNA及蛋白质表达;流式细胞术检测细胞周期及Ki67表达。结果显示,与LF共培养时,AECII能较好地保留其细胞形态,SP-CmRNA及其蛋白质表达明显增加,而AQP5mRNA及其蛋白质表达则明显减少;LF促进AECII增殖,使G2/M、S期细胞及表达Ki67 细胞的比率明显增多。结果提示,AECII与LF共培养时,能更好地保留其细胞形态、分化及增殖特性。     

降钙素基因相关肽对LPS诱导肺泡巨噬细胞分泌MMP-9的影响

目的：探讨降钙素基因相关肽（CGRP）对经脂多糖（LPS）诱导大鼠肺泡巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的影响及其机制。方法：对经LPS诱导的大鼠肺泡巨噬细胞给予不同浓度的CGRP干预,并同时设置对照,分别收集上清液,采用明胶酶谱法测定LPS、CGRP或二者联合干预后大鼠肺泡巨噬细胞分泌MMP-9的变化。结果：①正常肺泡巨噬细胞仅分泌少量MMP-9,各浓度CGRP对其分泌无影响,但经LPS诱导后MMP-9的分泌均明显升高（P〈0．01）;②不同浓度的CGRP干预呈剂量依赖方式降低LPS诱导的肺泡巨噬细胞MMP-9的分泌（P〈0.01）。③CGRP下调LPS诱导的肺泡巨噬细胞MMP-9分泌的作用可为蛋白激酶C阻断剂H-7及钙调蛋白阻断剂W-7部分逆转（P〈0.05）。结论：CGRP可明显下调LPS诱导的大鼠肺泡巨噬细胞MMP-9活性,其机制与蛋白激酶C及钙调蛋白信号途径有关。     

氨溴索与碳酸氢钠序贯灌洗佐治支气管扩张感染疗效分析

目的探讨氨溴索与碳酸氢钠灌洗治疗支气管扩张反复感染的疗效及意义。方法将支气管扩张反复感染住院患者,分为灌洗组(常规治疗方法 +支气管局部注药灌洗34例)、对照组(常规治疗方法 38例),治疗2周后进行临床评估,随访半年。结果灌洗组总有效率与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),半年急性加重次数与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论在常规治疗基础上局部氨溴索、碳酸氢钠序贯灌洗能提高支气管扩张感染疗效、减少半年急性加重次数、改善生活质量,通过改善微环境来维持菌群平衡值得借鉴、推广。     

周期性机械牵张对肺泡Ⅱ型上皮细胞Cyr61表达的影响

目的研究周期性牵张肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549细胞对Cyr61表达的影响。方法对肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549细胞施加周期性机械牵张应力。加载频率0.5 Hz,加载时间2 h,加载应力分别为5%,15%,30%。加载应力为15%,加载频率0.5 Hz,加载时间分别0,15 min,30 min,60 min,120 min。每个实验均设立空白对照即不给予机械应力。用PCR法测定Cyr61 mRNA的表达,用western法测定Cyr61蛋白含量。结果随着加载应力的增加和加载时间的延长,Cyr61蛋白含量和mRNA表达均增加(P<0.05);施加不同加载幅度后,Cyr61蛋白含量和mRNA表达均增加(P<0.05)。结论肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-8的产生和释放与周期性的机械牵张应力呈强度和时间依赖性。     

肺上皮细胞自噬体在结核分枝杆菌感染中保护作用的分子机制

目的：构建Atg5．真核表达载体并瞬时转染肺上皮细胞细胞株,探讨自噬在结核分枝杆菌感染上皮细胞中保护作用的分子机制。方法：设计针对Atg5的RNAi序列,化学合成后经过变性,退火连接到pSilencerTM3．1-H1hygro真核表达载体,经测序验证其正确性。脂质体法瞬时转染真核细胞A549,免疫印迹法检测瞬时转染的效果。用结核分枝杆菌分别感染正常和自噬表达低下的A549细胞．通过检测LDH来观察细胞的坏死情况。结果：成功的构建了pSilencerTM3．1-H1hygro真核表达载体并建瞬时转染了A549细胞株,成功抑制了细胞的自噬功能。Atg5-细胞对结核杆菌的抵抗能力下降。结论：在自噬表达低下的细胞中,细胞对结核分枝杆菌的抵抗能力有明显下降。在结核分枝杆菌感染上皮细胞的过程中,自噬是一种保护机制。     

香烟烟雾提取物抑制肺泡上皮细胞的增殖并诱导其凋亡

香烟烟雾提取物（cigarette smoke extract,CSE）中含有丰富的氧化剂和自由基,由它所引起的氧化应激可导致肺泡壁的损伤进而发展为肺气肿.近年来,围绕CSE损伤肺泡壁作用机制的研究较为活跃,但其结果却一直存在着分歧.本实验的目的是观察CSE对肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用并探讨与其相关的分子机制.MTT比色法的结果显示,CSE以时间和剂量依赖性的方式降低细胞的增殖活力,流式细胞术的分析结果表明细胞增殖周期被阻滞在G1/S期.Hoechst 33258染色以及透射电镜观察从形态上确认CSE诱导细胞凋亡的发生,DNA梯的出现和Annexin V-FITC/碘化丙啶双染色的结果从分子水平得到进一步的证实.同时,运用流式细胞术检测到CSE诱导的凋亡伴随着Fas受体的高表达和caspase-3的显著活化.另外,使用H2DCFDA染色,经激光共聚焦显微镜术测得细胞内氧自由基在细胞受到CSE刺激以后大量快速积累.结果表明CSE能够抑制肺泡Ⅱ型上皮细胞来源的A549细胞的生长和增殖,并诱导细胞凋亡,由Fas受体所介导的死亡受体途径参与此凋亡过程,而CSE所引起的氧化应激则可能是阻止肺泡上皮细胞生长增殖并诱导其凋亡的始动因素.     

Ghrelin抑制H2O2诱导的肺泡上皮A549细胞中IL-8的产生

目的:通过细胞培养的方法,初步研究了生长激素释放肽Ghrelin在氧化应激相关的肺泡上皮细胞炎症反应中的作用.方法:首先是用双氧水(H2O2)刺激A549细胞建立肺泡上皮细胞炎症反应模型,分别加入不同浓度的Ghrelin及普通培养基培养A549细胞,用酶联免疫吸附技术(ELISA)从蛋白水平检测上清液中IL-8的含量,采用逆转录聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测炎性细胞因子IL-8mRNA的表达.结果:H2O2可以使A549细胞IL-8蛋白的释放及IL-8mRNA的表达明显升高(P＜0.05),而用Ghrelin干预后IL-8的释放及IL-8mRNA的表达被抑制,明显低于单纯H2O2刺激的模型组(P＜0.05),且随着浓度的增加Ghrelin的这种抑制作用逐渐增强.结论:分别从蛋白水平和基因水平证明了Ghrelin能够抑制H2O2诱导的肺泡上皮A549细胞中IL-8的产生,由此推测Ghrelin可能能够抑制以COPD、支气管哮喘为代表的氧化应激相关的肺部炎症反应.     

猪小肠移植术供肠的灌洗和保存

目的探讨围手术期移植小肠灌注和保存的方法。方法切取猪供肠后,采用100 cm左右高度、略加压法,经移植肠血管以15 mL/min左右灌洗速度持续灌注4℃ 3%羟乙基淀粉注射液、4℃生理盐水保存移植肠。移植前对保存的移植小肠进行组织学检查。结果供肠总灌注时间为50.5±10.6 min;冷缺血时间为80.24±24.62min。组织学检查显示移植肠组织学没有明显改变。移植肠存活良好。结论采取上述方法在短时间内可以提供质量良好的供肠。     

猪肺表面活性物质对海水淹溺性肺损伤大鼠治疗的量效关系

目的:探讨猪肺表面活性物质(PPS)对海水淹溺肺损伤大鼠的治疗效果及量-效关系.方法:24只SD大鼠气管内注入海水观察120min,建立海水淹溺肺损伤模型后,随机等分为4个治疗组(n=6):生理盐水对照组,100mg/kgPPS组,150mg/kgPPS组和200mg/kgPPS组.分别监测4组大鼠给药后30min、60min、120min的BR和Pa02,120min后放血处死,计算大鼠存活率及支气管肺泡灌洗液(BALF)中TNF-α浓度和TP含量,取肺观察肺组织形态学改变.结果:各剂量PPS治疗组与对照组比较在治疗后各时间点的BR、TNF-α浓度和TP含量均有不同程度下降(P＜0.05),Pa02及存活率上升(P＜0.05),肺脏的病理形态学有明显改变.结论:单独应用PPS能明显减轻海水淹溺肺损伤.并且存在量-效关系.