硫矿硫化叶菌MTSase和MTHase基因的克隆与表达

从嗜热硫矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)ATCC35092的基因组中用PCR方法扩增得到编码MTSase和MTSase的基因,分别将其插入原核表达载体pTrc99a中,并转入大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达。MTSase和MTHase酶活产率达到了31.3U/g(wetcell)和403U/g(wetcell)。在75℃,pH5.0条件下,两酶联合作用转化淀粉生产海藻糖,当淀粉浓度为15%,DE值为10时,海藻糖转化率最高为53.6%。     

LysM结构域及其与植物-真菌相互作用的关系北大核心CSCD

在长期的进化过程中,植物与真菌之间形成了复杂而又紧密的联系,其中最主要的就是侵染与防御的关系。植物的抗病性由于涉及农作物、林木的生长与产量,逐渐成为研究热点。在植物免疫系统中,对病原真菌的识别是一个重要环节。目前认为在这一过程中,LysM结构域起到了极为关键的作用。植物细胞膜上有含LysM结构域的识别受体,该受体可以结合真菌细胞壁上的几丁质,并将信号传递到胞内,从而启动免疫反应。在真菌中,同样具有含LysM结构域的基因,主要是一类效应因子。它们可能参与真菌在侵染过程中的"伪装",以逃避植物的识别。该文以LysM结构域在植物-真菌相互作用中扮演的角色为着眼点,讨论有关研究的意义与趋势,并对如何利用LysM结构域的相关研究进行有效的抗病育种提出了新的设想。     

Medium optimization of α-glucosidase inhibitors production by response surface analysis

[目的]采用响应面法对戈壁三素链霉菌PW409发酵合成α-糖苷酶抑制剂的培养基进行优化.[方法]采用Plackett-Burman法筛选影响α-糖苷酶抑制剂产生的关键因素,用最陡爬坡试验逼近关键因素的最大响应区域,采用Box-Behnken设计以及响应面分析法,得到各因素的最佳浓度,通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对发酵液中α-糖苷酶抑制剂进行定量分析.[结果]发酵培养基中可溶性淀粉、KNO3和K2HPO4的浓度对α-糖苷酶抑制剂的产量影响较大.优化后的培养基组成为:可溶性淀粉9.01 g/L,KNO311.0 g/L,K2HPO4 0.32 g/L,MgSO4·7H2O 0.50 g/L,FeSO4·7H2O 0.01 g/L,pH 7.5.[结论]在此优化条件下,链霉菌PW409发酵液对麦芽糖苷酶的半数抑制浓度IC50为22 mg/L,抑制活性较优化前提高了近10倍.发酵液中的1-脱氧野尻霉素含量可达7.84 mg/L,较优化前提高了668倍,米格列醇的含量可达0.94 mg/L,较优化前提高了10倍.     

红纹黄单胞菌a-氨基酸酯水解酶的克隆、序列分析及热稳定性提高

【目的】克隆红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶基因全序列,对序列进行生物信息学分析,并提高酶的热稳定性。【方法】利用多聚酶链式反应(PCR)克隆α-氨基酸酯水解酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,预测红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的三维结构;通过定点突变替换氨基酸序列中高度柔性的位点,提高该酶的热稳定性。【结果】从红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrillineans)中扩增得到α-氨基酸酯水解酶基因aeh(GenBank登录号JF744990),核苷酸序列长度1 917 bp,编码638个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str.GPE PC73的肽酶及地毯草黄单胞菌Xanthomonas axono-podis pv. citri str. 306的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶氨基酸序列相似性最高,分别为91%和83%,系统进化分析表明,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str. GPEPC73的肽酶亲缘性最高。基于预测的三维模型,对高度柔性的位点进行饱和突变,从282株突变体中筛选得到3株T50较野生型高5°C以上的突变体。【结论】对红纹黄单胞菌AEH的氨基酸序列分析有助于探索同源蛋白的进化过程。对高度柔性位点进行饱和突变的策略可以用于提高热稳定性。     

氨基甲酸乙酯水解酶的家族生物信息学分析

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate,EC)是酒精饮料生产过程中自然产生的副产物,具有潜在的致癌性和遗传毒性,成为影响人们健康的隐患.利用氨基甲酸乙酯水解酶(Urethane hydrolase,UH)消除酒精饮料中已存在的EC具有直接、高效的作用.为了进一步探索EC水解酶的功能与作用,本实验利用生物信息学的方...     

烟草磷酸吡哆醛水解酶的分离纯化与表征

采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换、Sephadex G-100凝胶过滤和SP Sephadex C-25阳离子交换柱层析等步骤,对烟草磷酸吡哆醛水解酶进行了分离纯化。结果表明:该酶被纯化了119.6倍,得率为28.49%,经凝胶过滤和SDS-PAGE测得该酶的全分子量为49.6kDa,亚基分子量约为25kDa;该酶最适温度为50℃,最适反应pH为5.5;Mg2+、Ca2+、Mn2+等对该酶有激活作用,金属离子螯合剂EDTA对酶有抑制作用,加入Mg2+后抑制作用得到解除;在最适反应条件下,测得反应底物磷酸吡哆醛(PLP)和磷酸吡哆胺(PMP)的Km值分别为0.23mmol/L和0.56mmol/L。     

UHRF2结构域突变体的原核表达与纯化

目的构建UHRF2各个以结构域为基础的突变体原核表达载体,在大肠埃希菌中表达并对融合蛋白进行纯化和鉴定。方法以pCMV-3xFlag—UHRF2为模板,PCR扩增UHRF2的各个结构域基因片段,各PCR产物经酶切后连接到pGEX-4T-1载体上;将重组载体转化大肠埃希菌（BL21菌株）,IPTG诱导表达各GST融合蛋白,超声波破碎细菌,离心收获蛋白并经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（glutathione sepharose 4B）亲合纯化;纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色或免疫印记实验鉴定各蛋白表达情况。结果成功构建了UHRF2结构域突变体的原核表达载体,各突变体蛋白表达正确。结论UHRF2各结构域突变体的成功构建便于用GST pull—down实验研究UHRF2参与与其它蛋白相互作用的结构域,为了解UHRF2功能打下了基础。     

植物乳杆菌JPP2胆盐水解酶相关基因克隆和表达

通过PCR方法从植物乳杆菌JPP2中扩增出胆盐水解酶（BSH）相关基因bsh3,利用中间克隆载体pMD19-T将其构建于表达载体pET-28b上,并转化入表达宿主菌E．coli BL21（DE3）,成功构建重组BSH的工程菌。核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,正确克隆出目的基因。诱导表达后,SDS-PAGE电泳结果显示出特异性蛋白质条带,其分子量约为38kDa。此单克隆体系的构建为进一步研究BSH的功能奠定基础。     

通过分析来自Pyrococcus abyssi的腈水解酶中带电基团位置变化探讨蛋白耐热机制

蛋白含带电侧链基团的氨基酸的位置对蛋白质的热稳定性有很大的影响,目前,往往采用蛋白质结构模型"静态"分析这一影响。本文以1株耐热的腈水解酶作为研究对象,构建并异源表达了该酶,对其酶学性质进行初步分析。利用Discovery Studio对该酶进行同源建模,得到空间结构。将此空间结构利用Gromacs软件在不同温度下进行分子动力学(MD)模拟,使用Macrodox软件计算蛋白质所有带电氨基酸残基的包埋率与溶剂可接触性面积(SA),发现在不同温度下,部分氨基酸带电基团的SA值会发生显著变化。说明通过静态分析并不一定能够得到非常准确的结果,而应进行动态分析。     

金属螯合载体固定重组腈水解酶

以琼脂粉为基质制备金属螯合载体,并用于固定重组腈水解酶。研究发现:制备金属螯合载体最合适的金属离子为Zn2+。当Zn2+离子浓度0.3 mol/L、给酶量15.6 mg/g、固定化pH 8.0、固定化温度40℃时,制得的固定化酶活性最高。固定化酶最适反应温度为50℃、最适反应pH为7.0。当扁桃腈浓度为10 mmol/L、反应1 h时,固定化酶最大产率为0.041 mmol/(g·h);在反应12 h时,产物e.e.值可达到99%以上。固定化酶重复使用8次以后,酶活力仍保持在45%。