福建省白纹伊蚊中登革病毒的分离与鉴定

近年来福建省登革热(Dengue fever,DF)输入性病例持续存在,且登革热的主要传播媒介白纹伊蚊在全省内广泛分布,为了解福建省福州市登革热的媒介白纹伊蚊携带登革病毒(Dengue virus,DENV)状况,2017年10月7日在福州市台江区元一花园小区内开展伊蚊监测,采用双层叠帐法捕获255只白纹伊蚊蚊体研磨液上清提取核酸后用实时荧光RT-PCR法检测DENV特异性核酸,将检测阳性的蚊体研磨液上清接种C6/36细胞进行病毒分离,成功分离到1株DENV病毒株mosquito13/Fujian/2017;经实时荧光RT-PCR法鉴定所分离病毒株的血清型为I型;利用型特异性引物通过RT-PCR扩增病毒E基因并测序进行分子遗传特性分析;E基因核苷酸和氨基酸同源性分析显示,该毒株与2017年10月17日同小区本地登革热病例血清中分离得到的登革毒株E基因序列完全一致,与越南2014年分离株KT825033/Vietnam/2014核苷酸(99.7%)和氨基酸(99.8%)同源性最高;系统进化树分析表明所分离登革病毒毒株的基因型为I型,与东南亚地区的越南,泰国,柬埔寨等国家进化关系相近,可能输入来源于东南亚国家。本研究证实了登革热外潜伏期的存在以及白纹伊蚊在登革热疫情传播过程中的媒介作用,提示在登革热的防控工作中媒介登革病毒监测、检测的重要性,也提示福建省需要加强输入来源监测,特别是东南亚入境人员的监测。     

登革病毒3'UTRΔ30系列疫苗的研究进展

登革病毒引发的登革热等疾病每年在全球范围内造成了相当大的经济、医疗、社会负担,严重威胁到人类生命健康。在目前研究的各种登革病毒疫苗中,采用反向遗传技术制得的3'UTRΔ30系列减毒活疫苗由于其免疫原性好,效价高,成本低等特点,在临床试验中展现出良好保护作用,研究推进快。能对四种血清型登革病毒都产生均衡免疫保护的3'UTRΔ30四联疫苗已处于III期临床试验阶段,效力强,不良反应少,待随访期结束后有望上市,是当今最有前景的登革减毒灭活疫苗之一。为更深入了解3'UTRΔ30系列疫苗,现主要从起源、制备方法、临床研究等方面进行介绍。     

PTEN 通过下调自噬活性抑制登革病毒2型感染

为探讨PTEN、细胞自噬与登革病毒2型（DENV-2）感染之间的关系及可能机制,本研究将DENV-2以不同感染复数（MOI）和不同持续时间感染人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）,蛋白免疫印迹法检测PTEN表达及指示细胞自噬的LC3型别转换情况;进一步构建pLenti-PTEN和pLenti-shPTEN表达质粒,包装成慢病毒,感染 HUVEC以建立稳定表达细胞系,并检测 PTEN过表达及敲低对自噬标记尤其是LC3Ⅱ／LC3Ⅰ比值、DENV-2 capsid蛋白和mRNA水平及子代病毒颗粒感染性的影响。结果显示,PTEN下调可抑制细胞自噬水平,继而降低DENV-2 capsid蛋白表达和子代病毒颗粒释放,提示 DENV-2感染 HUVEC发生的PTEN蛋白表达下调很可能是宿主细胞本身的一种针对DENV-2感染的保护性反应。     

登革病毒感染的免疫与免疫病理的研究进展

登革病毒感染是世界上热带与亚热带地区一个严重的公众卫生健康问题,本文综述了登革病毒感染后机体免疫的改变,并从抗体、Ｔ细胞激活及细胞因子过量释放方面探讨了登革出血热（ＤＨＦ）／登革休克综合征（ＤＳＳ）的发病机理。     

应用DNA-RNA斑点杂交法检测登革病毒核酸

新近制备了大量纯化的pEH920 DNA,该质粒DNA插入了登革病毒2型核酸片段的互补DNA。以[a-~(32)P]dCTP按缺口转译法标记pEH 920 DNA作为探针,以感染病毒的蚊细胞c_6/36培养上清作标本,应用DNA-RNA斑点杂交法检测了登革病毒核酸。结果显示同位素标记探针(pEH 920)与登革病毒2型标本反应最强,具有一定的型特异性。但与其它血清型登革病毒也呈一定交叉反应。初步探讨了探针的敏感性,至少可检出TCID_(50)625的登革病毒2型核酸。     

应用生物素标记的凝集素分析登革Ⅱ型病毒糖蛋白

应用十二种生物素标记的凝集素,分析了经SDS-PAGE和电转印分离的登革Ⅱ型病毒(D_2V)糖蛋白。结果表明:D_2V的包膜糖蛋白E可与三种D-甘露糖特异的凝集素(conAPSA及LCA)结合,提示E蛋白的寡糖链为高甘露糖型。D_2V的糖基化非结构蛋白NS_1可与两种D-甘露糖特异的凝集素conA及LCA结合,提示NS_1的寡糖链亦为高甘露糖型。实验结果还显示了一些可能为C6/36细胞感染D_2V后新合成、合成量增加或减少以至完全受抑制的糖蛋白成分,有关这些糖蛋白的性质、功能、意义尚不清楚。在本实验条件下,这种生物素标记凝集素印迹法证明了其敏感性和糖基特异性,可以作为分析各种微量含糖大分子的一种实用方法。     

登革2型病毒结合血管内皮细胞分子机制的初步研究

以ECV304细胞为对象分析登革病毒感染血管内皮细胞的机制.2型登革病毒(DEN2)吸附后微量蚀斑法测定ECV304细胞上清释放的病毒滴度,证实该细胞对DEN2感染有一定的敏感性.机械刮取或胰蛋白酶消化法收集ECV304细胞分离膜蛋白,SDS-PAGE见胰酶处理样品缺失一43 kDa的膜蛋白.将ECV304细胞膜蛋白与35S-Met标记的DEN2进行病毒重叠蛋白结合试验(VOPBA),有29、34和43 kDa的3种膜蛋白可与DV结合,其中29 kDa的蛋白对胰酶耐受.培养的ECV304细胞中加入重组E蛋白(rEgp)对DEN2吸附进行阻断试验,微量蚀斑法与间接免疫荧光表明rEgp抑制DEN2感染该细胞.VOPBA中rEgp可阻断病毒与细胞膜蛋白的结合.结果表明ECV304细胞表面可能存在29、34、43 kDa的3种与DEN2结合的相关蛋白,DEN2 E蛋白可直接介导DV感染血管内皮细胞.     

RNA干扰抑制登革病毒复制的研究

为了研究RNA干扰(RNAi)对Ⅰ型登革病毒(DENV-1)在白纹伊蚊C6/36细胞内复制的影响,本研究设计并合成针对I型登革病毒Pr M基因的小干扰RNA,以脂质体法转染入C6/36细胞后,用DENV-1感染已转染的细胞,观察细胞病变效应,MTT法检测细胞存活率,荧光定量RT-PCR检测登革病毒RNA含量。结果表明:转染siRNA的C6/36细胞在受登革病毒攻击7天后仍无明显细胞病变效应,细胞存活率比对照组提高2.26倍,细胞内登革病毒RNA拷贝数比对照组降低约97.54%。说明利用RNA干扰技术能有效抑制登革病毒核酸在C6/36细胞内复制,并对细胞具有一定保护作用,为登革热的防治提供了新的思路。     

登革病毒感染HepG2-严重联合免疫缺陷小鼠模型的建立

缺乏合适的动物模型将严重限制登革病毒（DENV）致病机制研究的进展。本研究旨在构建DENV感染小鼠模型,为阐明其致病机制提供实验材料。首先在严重联合免疫缺陷（ SCID）小鼠腹腔内接种人肝癌细胞株HepG2,构建人鼠嵌合体动物模型;移植后10 d腹腔接种DENV,通过检测病毒在体内分布及主要器官的组织学改变,评价该动物模型的实用价值。结果显示,在SCID小鼠成功移植HepG2并感染DENV后,出现病毒血症及主要器官严重损伤等现象,但无后肢麻痹等人类登革热无关症状。本研究成功构建了SCID-HepG2人鼠嵌合模型,该模型能支持DENV复制,并表现出部分人类DENV感染的临床症状,为研究DENV的致病机制提供了有价值的实验材料。     

登革病毒进化遗传学与毒力关系研究进展

登革病毒感染是世界上最流行的虫媒病毒性疾病之一,致病机制尚不清楚。登革病毒的进化遗传学研究发现,其基因多样性正在增加,导致产生大量不同毒力的病毒株,这意味着人类将受到更多样的致病性登革病毒的攻击。此研究成果为强毒力病毒理论提供了依据。