响应面法优化苦荞麸皮粉蛋白质提取工艺

目的：分析苦荞麸皮粉中蛋白含量及其蛋白组成。方法：采用碱法提取-等电点沉淀分离蛋白。在单因素试验基础上,选取料液比（w/v）、pH、时间等3个影响因素,采用响应面法 （Box-Behnken 中心组合）优化苦荞麸皮粉蛋白提取工艺。结果：料液比、pH、时间对麸皮蛋白提率有显著影响,影响顺序为料液比> pH>时间。响应面优化得到最佳提取条件为pH 10.5、料液比1∶35、时间3 h 40 min,此条件下苦荞麸皮蛋白提取率为（97.31±4.64）%。结论：本研究为有效开发利用苦荞麸皮粉的蛋白提供科学依据。     

基于分子标记的入侵陕西草地贪夜蛾种群生物型分析

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda J. E. Smith是一种世界性入侵害虫,为了明确入侵陕西的草地贪夜蛾的种群生物型并了解其发生及扩散规律,本研究对采集自陕西省8个地市180个草地贪夜蛾样本分别进行了基于COI和Tpi分子标记的生物型鉴定。分析发现入侵陕西的草地贪夜蛾84%是水稻型母本与玉米型父本杂交形成的杂合玉米型草地贪夜蛾。COI分子标记的结果显示,样本中水稻型占比为84.44%,玉米型为15.56%;基于Tpi基因片段的结果表明除商洛样本SL-3外,其它样本均为玉米型。值得注意的是,SL-3与非洲特异型序列同源性达100%,此非洲特异单倍型为陕西省内首次、国内第2次出现。本研究为草地贪夜蛾的迁飞扩散规律及早期预警提供了新的理论基础。     

花生根瘤菌Bradyrhizobium sp.MZ5 III型分泌系统调节基因ttsI突变体的功能分析

[目的]探究慢生型花生根瘤菌III型分泌系统在花生-根瘤菌互作的功能。[方法]本研究采用同源重组和三亲本接合转移的方法,构建Bradyrhizobium sp.MZ5的III型分泌系统调节基因ttsI突变体;荧光定量PCR检测添加大豆苷元（Daidzein）和染料木黄酮（Genistein）诱导物后野生型和突变株转录水平上ttsI的表达量变化及其差异;蛭石结瘤实验分析ttsI基因突变对花生结瘤能力的影响。[结果]在转录水平上,大豆苷元和染料木黄酮对MZ5的III型分泌系统调节基因ttsI的表达具有显著的抑制作用（P<0.05）。在MZ5△ttsI突变体中ttsI基因的表达量都明显下调,与野生型菌株的相比都达到极显著水平（P<0.001）。蛭石结瘤实验表明,与野生型菌株相比,MZ5△ttsI突变体在不同花生品种的结瘤数和地上部干重都显著性降低。根瘤石蜡切片表明,MZ5△ttsI突变体在根瘤内的含菌量少于野生型菌株。[结论]Bradyrhizobium sp.MZ5菌株中的III型分泌系统在花生-根瘤菌互作中对结瘤有积极的促进作用。     

桑树内生拮抗菌的分离鉴定及其对桑断枝烂叶病的生防初探

【目的】本研究从健康桑树茎中分离筛选对桑断枝烂叶病菌具显著拮抗作用的内生细菌,为该病生物防治奠定研究基础。【方法】采用组织培养法分离桑树内生菌,抑菌圈法和平板对峙法筛选抑菌活性稳定的内生拮抗菌;根据形态学、生理生化特征检测和基于16SrDNA、gyrA和gyrB基因的系统发育分析对拮抗菌进行菌种鉴定;利用抑菌圈法测定拮抗菌株活性发酵液热稳定性,菌丝生长速率法检测活性发酵液抑菌谱;并通过观察拮抗菌对桑断枝烂叶病菌BoeremiaexiguaGXH1菌株生长及菌丝形态的影响,扩增抑菌活性物质合成关键基因,以及采用酸沉淀法提取拮抗菌株脂肽类化合物并进行高效液相色谱串联质谱分析(LC-MS),初步探究可能的抑菌机制。【结果】从健康桑树茎中共分离获得17株桑树内生细菌,并从中筛选获得一株对桑断枝烂叶病菌B.exiguaGXH1有稳定拮抗作用的桑树内生细菌NPJ13菌株。该菌株形态学、生理生化特征与芽孢杆菌属一致,基于16SrDNA、gyrA和gyrB基因序列的系统发育分析结果显示该菌株与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)的亲缘关系最近,且处于系统发育树的最小分枝,故将NPJ13菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌,命名为B. velezensis NPJ13。NPJ13菌株对灰霉病菌SWU5、核地杖菌SXSG-5、核盘菌PZ-2及烟草疫霉SWU20等12种病原真菌具有不同程度的拮抗作用,其活性发酵液具有较好的热稳定性。NPJ13菌株会导致桑断枝烂叶病菌GXH1菌丝发生扭曲、膨大、透明度增加、断裂等畸变现象;基因检测结果显示NPJ13菌株基因组中具有PKSI、NRPS、Sfp、ItuD、Srfc等5种抑菌活性物质合成关键基因,LC-MS检测结果表明菌株NPJ13脂肽类粗提物中含有表面活性素和伊枯草菌素。【结论】本研究分离筛选获得一株对桑断枝烂叶病菌具有显著拮抗作用的桑树内生细菌B. velezensis NPJ13菌株,为桑断枝烂叶病的生物防治提供了候选菌株。     

桑椹肥大性菌核病菌(Ciboria shiraiana)分生孢子的形成和致病性

[目的] 研究桑椹肥大性菌核病菌分生孢子的生物学特性,诱导菌丝产生分生孢子的方法及产生途径,为桑椹肥大性菌核病的防治提供依据。[方法] 显微镜下面观察病果形成不同阶段以及人工诱导产生的分生孢子形态特征;测定不同温度和湿度对菌丝产生分生孢子的影响;分别用病果和人工诱导产生的分生孢子悬浮液接种健康的桑椹,统计其发病率;以不同发病阶段的病椹在PDA、诱导培养基上产生的菌丝和菌核为材料,通过qPCR方法检测相关基因的表达水平,研究cAMP途径对于分生孢子形成的影响。[结果] C.shiraiana在温度为20℃-30℃,相对湿度为50%-80%条件下可以产生大量的分生孢子。人工诱导产生的分生孢子和病果中的分生孢子形态差异较大;病果中分生孢子悬浮液侵染健康的桑椹,其发病率为37%,而人工诱导产生的分生孢子对桑椹不具有侵染能力;分生孢子梗和分生孢子可在马铃薯片上被诱导产生;外源添加的cAMP影响菌丝的形态和分生孢子的形成,但不影响菌核的形成。AC含量在桑椹发病的第2阶段增长迅速,在发病的第3阶段和第4阶段迅速下降,PKA在发病的桑椹中始终没有表达。[结论] 桑椹肥大性菌核病病果可通过分生孢子造成再次侵染。分生孢子的形成对cAMP途径中的AC和PKA表达量起负调控作用。研究结果能够进一步增加我们对病原菌侵染桑果所需外界环境条件的理解,同时也进一步完善了C.shiraiana的侵染循环和分生孢子形成途径。     

艾纳香内生真菌Diaporthe sp.次生代谢产物

【目的】从艾纳香内生菌J1中获得活性次生代谢产物。【方法】对菌株J1进行ITS序列分子鉴定,综合运用多种色谱技术对其发酵产物进行分离纯化,结合波谱学技术对其进行结构表征。【结果】经构建系统进化树,鉴定菌株J1为Diaporthe sp.,从该菌株大米培养基中分离得到7个单体化合物,经鉴定分别为Dicerandrol A (1)、Dicerandrol B (2)、4,6-dihydroxy-1H-isoindole1,3(2H)-dione (3)、Cytochalasin H (4)、Cytochalasin J (5)、4,6-dihydroxy-2,3-dihydro-1H-isoindol-1-one (6)、Cerebroside C (7)。所有化合物均为首次从该菌中分得,化合物1对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis KCTC 1021具有非常强的抑制活性,MIC值为0.125μg/mL。【结论】Diaporthe sp.富含抑菌活性化合物,具有开发成微生物源农药潜力。     

炭样小单孢菌产抗生素对水稻细菌性条斑病菌的抗菌作用及其机理

【背景】水稻细菌性条斑病菌为水稻细菌性条斑病的病原菌,土壤中分离到的一株具有广谱抗菌活性的炭样小单孢菌JXNU-1,其发酵产物(即抗生素JX)对植物病原菌具有较强的抑菌活性。【目的】研究抗生素JX对水稻细菌性条斑病菌的抗菌作用及其机理。【方法】采用杯碟法测定抑菌圈大小,二倍稀释法测定最低抑菌浓度、最低杀菌浓度,并且从菌体形态观察、电导率变化、培养液大分子漏出、蛋白质合成、核酸合成和膜电位变化6个方面探究其作用机理。【结果】抗生素JX对水稻细菌性条斑病菌的抑菌圈直径达18.84±0.28mm,最低抑菌浓度和最低杀菌浓度分别为1.39μg/m L和2.78μg/mL,且杀菌速度很快,作用12 h的杀菌率达100%。在抗生素JX作用下,水稻细菌性条斑病菌的细胞形态发生改变,培养液电导率、膜电位和大分子漏出量均随抗生素浓度增加而增大,但菌体蛋白质含量随着抗生素浓度增加而降低,同时,通过实时荧光定量PCR方法检测发现ef-p表达量下调。【结论】抗生素JX对水稻细菌性条斑病菌具有较强的抗菌作用,推测其抑菌机理是通过抑制菌体蛋白质的生物合成和影响细胞膜完整性而起作用。     

假单胞菌YL11对扩展青霉的抑制作用及其机理初探

【背景】苹果青霉病是由扩展青霉引起的一种重要的果实采后病害,影响果实品质导致苹果腐烂从而造成经济损失。【目的】研究假单胞菌YL11对扩展青霉的抑制作用和苹果采后青霉病的防治效果,并对抑菌机理进行初步探讨。【方法】以扩展青霉为供试菌株,研究不同浓度的假单胞菌YL11无菌发酵液对扩展青霉菌落直径、孢子萌发率、菌丝体干重、苹果损伤接种病斑直径扩展的影响,利用对电导率、核酸及蛋白释放量、AKP含量、SDH活性、ATP酶活性和ATP含量的影响对抑菌机理进行探究。【结果】假单胞菌YL11无菌发酵液能有效抑制扩展青霉生长,抑菌圈直径为22.33±0.27 mm,抑菌效价为71.67 mm/mL;能有效抑制孢子萌发,100%无菌发酵液对孢子萌发抑制率达到80.2%;对扩展青霉的生物量也有一定抑制作用,体积分数为100%时,菌丝体干重为4.7mg/mL,抑制率达到39.74%;无菌发酵液处理能有效抑制苹果青霉病病斑的扩展,3d时对病斑扩展的抑制率最大,达到47.1%;无菌发酵液处理均能引起电导率升高、胞内核酸和蛋白释放量增大、胞外AKP含量升高、SDH活性降低、ATP酶活性和ATP含量均降低,且随着发酵液浓度的增加效果越明显。【结论】假单胞菌YL11能显著抑制扩展青霉的生长,破坏细胞膜结构、降低能量代谢酶活性,从而扰乱扩展青霉的正常生长,对苹果青霉病有较好的生防效果,具有潜在的开发价值。     

生防放线菌Ahn75的荧光标记及其在水稻中的定殖

【背景】目前gfp标记基因已成为研究靶标微生物与宿主之间互作的一种重要工具。利用gfp基因标记生防菌株,可以对生防菌株的生存及定殖能力进行有效追踪。【目的】对生防放线菌Ahn75进行荧光标记,探讨其在水稻中的定殖规律,为研究Ahn75的稻瘟病防治机制奠定基础。【方法】首先通过电激转化将含绿色荧光标记基因(gfp)的质粒pIJ8655导入大肠杆菌ET12567中,然后采用接合转移的方法将gfp整合到Ahn75基因组上;通过平板对峙试验检验Ahn75-GFP在标记绿色荧光后对稻瘟病病原菌的抑菌活性;采用喷施孢子液的方式将带荧光标记的Ahn75-GFP定殖水稻,并利用荧光显微镜观察生防菌在水稻中的定殖情况;对定殖水稻中的内生菌进行重分离,探究菌株在水稻组织中的分布规律。【结果】PCR扩增和荧光观察表明,绿色荧光标记基因成功整合到生防放线菌Ahn75中。通过平板对峙试验,发现Ahn75-GFP对稻瘟病病原菌抑菌活性与原始菌株没有显著差别。在荧光显微镜下,可以观察到Ahn75-GFP能稳定定殖于水稻的根、茎、叶等组织中,而水稻内生菌重分离试验表明该菌株在茎中的定殖力最强。【结论】获得一株绿色荧光标记生防菌株Ahn75-GFP,结果显示该菌株定殖水稻效果良好,这对于研究Ahn75的稻瘟病防治具有重要意义。     

杨树溃疡病生防菌株N6-34抗菌活性物质的分离纯化与结构鉴定

【背景】杨树溃疡病是一种主要由葡萄座腔菌引起的杨树枝干病害,危害严重。前期从杨树中分离到一株内生拮抗细菌N6-34,研究表明该菌株拮抗效果好,对多种植物病原菌均有较强的拮抗作用。【目的】对拮抗细菌N6-34产生的抗菌活性物质进行分离纯化,并鉴定了活性物质组分的结构。【方法】通过硫酸铵盐析、甲醇抽提、分子筛、高效液相色谱等方法分离纯化N6-34菌株的抗菌活性物质,并对其进行结构鉴定。【结果】N6-34菌株发酵液经多步分离纯化,共获得14个组分,其中有13个组分具有抗菌活性,经一级质谱分析,获得了13种抗菌活性组分的分子量;经二级质谱分析,将13种抗菌活性物质鉴定为Fengycin A或Fengycin B的同系物或同分异构体。【结论】从N6-34菌株发酵液中分离获得了13种抗菌成分,为杨树溃疡病的生物防治提供了理论依据。