鹅源新城疫病毒ZJI株基因组cDNA克隆的序列修饰

将鹅源新城疫病毒ZJI株全基因组cDNA克隆通过酶切切下包含T7启动子区域和转录载体的片段,将其自身环化后获得约6．5kb的质粒。设计引物,利用基因定点突变技术,在此质粒上T7启动子与NDV Leader序列之间突变插入额外的3个G碱基,将此突变最终引入到原基因组cDNA克隆中。应用RT—PCR技术从尿囊液中扩增NDV基因组F／HN基因区域部分片段,利用限制性内切酶BsmBI将扩增片段连接,最终将原cDNA克隆中相应片段替换下。测序结果表明,原基因组cDNA克隆中特定位置碱基插入突变成功,F／HN基因区域碱基突变均得以纠正。以上cDNA克隆的修饰与替换为该毒株的反向遗传研究打下了基础。     

E83V对扩展青霉脂肪酶最适作用温度的影响*

利用重叠延伸PCR法对扩展青霉碱性脂肪酶(PEL)基因作了体外定点突变,获得了最适作用温度有所提高的突变体。含突变基因的重组质粒pPIC3.5K-lip-E83V在Pichiapastoris GS115中表达。对突变体表达产物PEL-E83V-GS与野生型表达产物PELGS作了比较:前者最适作用温度为45℃,比野生型提高了5℃;其热稳定性基本不变;突变体在37℃下的表达量为188U/mL,约为野生型的80%。最适作用温度的提高可能是由于83位亲水性的Glu用疏水性的Val取代,增加了脂肪酶     

植物类病变突变体的诱发与突变机制

植物类病变突变体（lesion mimic mutant,LMM）是在无明显逆境或病原物侵染时,植物自发地形成类似病斑的一类突变体。它涉及到细胞程序性死亡（programmed cell death,PCD）,往往能提高植物的抗病能力。因此,它对于揭示植物抗病反应机制,增加植物的广谱抗性具有重要意义。现就植物类病变突变体的诱发与表型特点、突变基因的分子定位与克隆及类病变表型的形成机制研究进展作一简要综述,以期为植物细胞程序性死亡机制和抗病分子作用机制研究提供有益的信息。     

G145R突变后乙型肝炎病毒表面抗原在酵母系统的表达及其免疫学特性分析

为了研究乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原(HBsAg)发生G145R突变后的免疫学特性改变情况,首先利用Pichia pastoris酵母表达系统分泌表达G145R突变后的HBsAg的preS2 S(中蛋白),用重组表达产物免疫小鼠,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot实验等研究其抗原性和免疫原性与野毒型HBsAg的异同。从150个阳性表达克隆中筛选出一株表达量最高的克隆株MC23,Western blot检测显示,表达的HBsAg中蛋白单体主带分子量在34kD、37kD左右,表达量约为200μg／L。用不同的HBsAg检测试剂检测其抗原性发现,G145R突变后的HBsAg,用绝大多数试剂都不能很好地检出,检出能力只有野毒型HBsAg的50％或更低,但用美国雅培公司的试剂检出能力可达野毒的98％。G145R突变后的HBsAg中蛋白免疫小鼠后,血清中可检测到1：1600的特异性表面抗体,该抗体与G145R突变后的HBsAg“a”决定簇合成肽P2—145R也能发生交叉反应,反应滴度为1：80。但该抗体和野毒型HBsAg蛋白以及野毒“a”决定簇合成肽P1-wt均不反应。上述结果表明,G145R突变后的HBsAg中蛋白在Pichia pastoris酵母系统得到了分泌表达,表达产物仍具有较好的免疫原性,但和野毒HBsAg相比,其抗原性和免疫原性发生了明显改变。     

一种新型无花瓣油菜突变不育系花器官的形态解剖研究

在自育的甘蓝型油菜(Brassica napus)无花瓣品系AP197中,发现并育成由4对隐性核基因控制的无花瓣油菜突变不育系AMS971.AMS是一种雄蕊心皮化为不结实的假性雌蕊而引起的新的雄性不育类型,不育性非常彻底,其植株形态特征与AP197相同.比较花器官发现,AMS971除一个正常的雌蕊外,还有6个梭形的心皮化假性雌蕊.假心皮化雌蕊上部变成近似倒U形的柱头结构区,下部是完全突变的半开裂心皮,其上着生4～14个不等的裸露的幼小胚珠;蜜腺比正常油菜小,数目为0～4个,这与AP197没有差异.AMS971的四轮花器官由于突变造成了大小和重量的重新分配.推断AMS为类似拟南芥属B功能缺失的突变体.     

甜菜夜蛾拓扑异构酶I氨基酸突变对其DNA解旋活性的影响

【目的】为了探究甜菜夜蛾 Spodoptera exigua 拓扑异构酶I（topoisomerase I, Top I）氨基酸突变对其DNA解旋活性的影响。【方法】通过克隆甜菜夜蛾 Top I 基因,构建原核表达载体,采用完全重叠PCR定点突变技术,向甜菜夜蛾Top I 的V420, L530, A653和S729（根据人Top I 氨基酸序列编号）4个位点引入突变,将改造成功的重组 Top I 基因转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,诱导重组蛋白表达、纯化,测定Top I突变对其解旋活性的影响。【结果】完全重叠PCR能实现甜菜夜蛾 Top I 定点突变。重组蛋白在体外得到稳定的表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析在96.0 kDa处出现特异性条带。通过对重组蛋白分离纯化并测定对质粒pBR322解旋酶活性,发现引入V420I, L530P和A653T突变后Top I的比活力显著降低,而引入S729T突变后比活力与野生型蛋白无显著差异。【结论】本研究证明在甜菜夜蛾Top I中引入V420I, L530P和A653T突变后,其对底物pBR322的解旋活性显著降低,为后期探索甜菜夜蛾Top I的定点突变与其对喜树碱及其衍生物敏感性的关系奠定了基础。     

采用花器喷雾法并基于Cre/lox系统定点整合拟南芥Rps2基因的技术体系研究

To improve site?specific integration technology system, site?specific integration of Rps2 target gene in Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh. was carried out based on Cre/lox system by floral spraying method. The results show that 1495 site?specific integration candidate plants are obtained by this method with a site?specific integration efficiency of about 0076%. After PCR and histochemical staining experiment verification, the positive plants of precise integration account for 8604%, in which, 6334% positive plants are single copy transformed plants. The results of quantitative real?time PCR (qRT?PCR) and hypersensitive reaction (HR) show that the site?specific integrated Rps2 gene can be transcribed and expressed normally. It is suggested that this system can greatly improve the stability and efficiency of site?specific integration genetic transformation system in plants.     

人类珠蛋白相关基因上游开放阅读框的变异分析

β-地中海贫血症是一种珠蛋白生成障碍的常染色体隐性遗传病。而γ珠蛋白基因的开放表达和胎儿血红蛋白的合成,是缓解β地中海贫血病人临床表型的一个重要因素。本研究针对202个血红蛋白相关调控基因或miRNA,对1802个β-地中海贫血症患者进行了目标区域捕获测序。通过生物信息学的分析,检测出了所有捕获区域内的突变。进一步对位于5′端非编码区(5′untranslated region, 5′UTR)的突变进行系统扫描,共计寻找到41个影响uORF(upstream open reading frame, uORF)有或无的功能性突变。从中选取了CHTOP基因(chr1:153606541 C>T)和TGFB1基因(chr19:41859418 G>A)的两个突变,通过定点诱变和双荧光素酶报告实验,在体外证实这两个突变均可显著地改变下游基因的表达。该研究结果为β-地中海贫血症临床表型的精确诊断提供了潜在的筛查靶点。     

气候变化背景下1964-2015年秦岭植物物候变化

以1964-2015年物候观测数据为基础,选取17种含乔木、灌木及藤本树种为研究对象,分析探讨了气候变化背景下秦岭地区植物物候变化规律及其差异性。结果表明:(1)52年来,秦岭地区物候始期普遍呈提前趋势,提前速率1.2d/10a,物候末期普遍呈推迟趋势,推迟速率3.5d/10a,物候生长期普遍延长;(2)秦岭地区物候突变发生于20世纪80年代,始期于1985年,末期于1984年。突变后,物候特征发生了显著变化,始期的提前速率较突变前显著加快,末期由突变前的提前趋势转变为极显著的推迟趋势,且变化速率和显著性均高于始期;始期与末期变化均表现出"趋同效应";物候年代际变化趋势显示,始期自2001-2005年起提前速率减缓,植物对气候变化的响应表现出适应性及滞后性。(3)秦岭物候变化存在树种差异,3大类树种始期的提前速率呈藤本、乔木、灌木依次增大,而末期的推迟速率则呈藤本、灌木、乔木依次减小。(4)秦岭物候变化存在南北差异,北坡始期的提前速率均高于南坡,而南坡末期的推迟速率均高于北坡。     

植物基因替换编辑技术研究进展

基因替换编辑是通过核酸酶介导的对目标基因进行定点敲入或替换的编辑技术,可以实现目的基因的定向修饰。本文从基因替换编辑技术的原理、实现方式与影响因素、应用及其前景等进行了总结与讨论,以期为通过定点基因替换或敲入技术开展高等植物基因功能鉴定与遗传改良研究提供参考。