蛋白质体外定向进化策略研究进展

定向进化已广泛应用于蛋白质的分子改造,是改善蛋白质特性的最有效策略之一。为了获得更高的突变效率,构建含有更多突变体的文库,不断地发明创新各种高效的蛋白质体外定向进化方法。对近年来出现的几种定向进化方法三核苷酸突变(TriNex)、序列饱和突变(SeSaM)、随机链交换突变法(RAISE)、重叠延伸蛋白域文库法(PDLGO)和迭代饱和突变法(ISM)的原理、特点及应用进行综述。     

基于谱域相干的细胞动态检测技术

将谱域光学相干层析技术（Spectral-domain Optical Coherence Tomography,SD-OCT）应用于细胞膜厚的动态检测,引入了光谱干涉测量方法,通过对干涉光谱信号进行离散傅里叶变换得到表示物体深度位置信息的光程差信号。搭建了一套SD-OCT测量系统并设计了专门用于细胞检测的样品平台,检测精度达到μm量级,信噪比达70 db,是一种快速、实时、非接触的细胞分子膜厚动态检测技术。     

NIRF泛素化p53的作用过程中NIRF与p53结合域的测定

NIRF(Np95/ICBP90-like RING finger protein)是2002年发现的一种核蛋白,其功能涉及细胞增殖调节、蛋白多聚泛素化降解、细胞癌变进程控制等领域．已有研究报道,NIRF能与p53相互作用, NIRF本身也是一个高度调节蛋白,在细胞正常的生理状态下发挥泛素化E3连接酶的作用,结合p53并将其降解,但NIRF与p53结合的蛋白结合域目前尚不清楚．本文研究证明,NIRF能与p53结合成复合体参与泛素化蛋白降解途径,并测定出NIRF与p53结合的区域．为了检测NIRF的蛋白结合域,将空载体和NIRF缺失突变体质粒分别转染于HEK293细胞,蛋白表达水平通过Western印迹用两种抗体分别检测. 结果显示,所有的突变体都能在细胞中表达,并且两种抗体检测结果完全一致. 同时,免疫共沉淀技术用于进一步分析实验结果. 由于泛素化蛋白通常伴随蛋白酶体通路介导的降解,免疫共沉淀的蛋白纯化过程中用蛋白酶体抑制剂MG-132以抑制蛋白降解. 本研究结果显示,NIRF 通过PHD区域与p53形成复合体. 该复合体可能参与蛋白分选、蛋白降解、DNA修复以及细胞凋亡等一系列重要的细胞活动,从而形成与细胞增殖相关的新的信号通路,在肿瘤的发生发展中可能发挥某种程度的作用．     

带有穿膜结构域的转录因子蛋白Oct4和Sox2的融合表达

目的:克隆、表达及纯化带有穿膜结构域的转录因子蛋白Oct4和Sox2。方法:根据GenBank中的Oct4和Sox2基因序列,在其3’端引入穿膜结构域11R,并在其两端引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,进行全基因合成;将目的基因克隆至pET41a载体,进行酶切鉴定及测序;将所获阳性重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对表达产物进行Western印迹鉴定;最后用Ni-NTA亲和层析柱对所获目的蛋白进行纯化。结果:质粒酶切鉴定结果表明带有目的基因的重组质粒构建成功;SDS-PAGE结果显示有相对分子质量约42×103和38×103的特异性蛋白表达条带,经Western印迹证实为目的蛋白;用Ni-NTA亲和层析柱纯化后,得到均一的Oct4和Sox2目的蛋白。结论:得到带有穿膜结构域的转录因子融合蛋白Oct4和Sox2,为今后安全开展诱导性多能干细胞研究奠定了基础。     

植物转录抑制子的结构特征及其作用机理

转录因子依转录调控能力可分为激活子和抑制子。植物转录抑制蛋白的分类依据很多,从作用方式上可分为主动抑制子和被动抑制子两大类：根据与DNA结合的方式则可分为锌指类、MYB类、AP2／EREBP类、bHLH类和bZlP类等。植物主动抑制子通过其含有的抑制域对转录直接起抑制作用。抑制域又可分很多类,但多数为含有类似EAR基序的保守性基序,其上具有几个保守性亮氨酸残基。植物转录抑制子主要通过对激活子或基本转录复合物产生作用及改变染色体结构3种方式来抑制目标基因的转录。有关植物转录抑制子的研究虽很欠缺,但以拟南芥SUPERMAN等抑制子的EAR基序为代表的研究表明,抑制域是阐明植物转录抑制子功能和下游基因表达调控机理的核心对象,而融合抑制子沉默技术（CRES-T）也为人为调控基因沉默带来了新的技术手段。     

核转录因子C/EBPβ的研究进展

C／EBPβ是转录因子C／EBPs(CCAAT enhancer binding proteins)家族的重要成员,其C端具有高度保守的DNA结合域和二聚化功能域。它主要通过对靶细胞基因转录的调节,参与细胞增殖与分化、肿瘤发生与凋亡、机体炎症反应等重要生命活动;其功能受到蛋白酶降解、磷酸化、蛋白质相互作用等多种途径的调控。本综述有关C／EBPβ的生物学功能及其调控机理近年来的一些研究进展。     

香溪河河流连续统特征研究

以香溪河附石藻类密度、藻类叶绿素a浓度、Shannon-Wiener多样性指数及生态系统初级生产力随河流级别的变化为例探索该河流的连续统特征。结果表明,附石藻类密度、藻类叶绿素a浓度和Shannon-Wiener多样性指数总体上都有随着河流级别增加而增加的趋势,但在1～3级河段之间这种趋势并不明显,甚至出现了逆转。河流初级生产力也有随河流级别增加而增加的趋势,并在第4级河流达到最大,随后有所下降。在全水系范围内河流初级生产力(P)与群落呼吸(R)比值P／R均大于1,说明香溪河是一条以自养生产为主的河流。所研究的特征并不完全与连续统概念的预测相一致,表明河流已经受到了一定程度的人为干扰。     

土地覆被变化的水文响应模拟研究

采用近年来快速发展的水文模型模拟的手段,应用SWAT模型模拟了长江上游梭磨河流域不同土地覆被情景下的多年降水径流关系,定量地评估了梭磨河流域的土地覆被变化对径流、蒸发和洪峰流量的影响．结果表明,随着土地覆被状况由无植被到全是有林地覆被,径流深减小,蒸发量增加,枯季径流深减小幅度明显小于雨季的减小幅度,而且雨季初期径流深减小的幅度大于雨季后期．相同的洪水重现期,流域全为有林地覆被的情景比无植被的情景洪峰流量减小31．2％．现状覆被与未来最佳覆被之间在较大洪水上的差别不大,在较小洪水上的差别稍大．     

安宁河流域稻米生化品质与气候条件的关系

通过“合系39”在四川安宁河流域无控制的地理分期播种大田试验及稻米生化品质室内分析,定量研究了从穗前40d到成熟期各阶段气象条件对稻米生化品质的影响及关键时期,建立了稻米生化品质各组分与关键期平均温度、温度日较差和日照时数的综合关系模型．结果表明,气候生态条件对稻米生化品质各组分有重要影响,且不同组分的影响形式和关键时期不同．其组分与气候生态因子最显著相关的时段或在齐穗前,或在齐穗后,或从齐穗前持续到齐穗后．该模型于2002～2003年应用在安宁河流域优质稻生产决策中．累计推广优质稻7．3×10^4hm^2,较2001年增加3．0×10^4hm^2,农民增收2亿元,促进了优质稻的迅速发展．     

鸭瘟病毒gB蛋白N端主要抗原域的表达及间接ELISA检测

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因.将克隆的基因定向插入pET-32a的EcoR Ⅰ和HindⅢ之间,构建了gB蛋白主要抗原域原核表达载体pET-gB1.将pET-gB1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了DPV gB蛋白主要抗原域的高效表达.免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性.应用His·Bind亲和层析柱纯化重组DPV gB蛋白,以纯化的重组gB1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA.结果表明,抗原的最佳包被浓度为6.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490＞0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2.应用igB1-ELISA对鸭血清样品进行检测,结果表明igB1-ELISA与全病毒包被的iDPV-ELISA符合率达到95.6%.