固定化细胞拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的研究

【目的】筛选鉴定一株产酯酶用于选择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株,利用该菌株固定化细胞催化拆分外消旋底物。【方法】通过富集培养、罗丹明B平板初筛及复筛培养获得一株选择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株,通过对其形态、生理生化特征及16S r DNA序列分析,确立该菌株系统发育地位。优化了利用硅藻土-戊二醛吸附交联法对该菌体细胞固定化的条件,研究固定化细胞催化性质及操作稳定性。【结果】该菌为革兰氏阴性菌,鉴定其为甲基球状菌属(Methylopila)。固定化体系最优条件:聚乙烯亚胺0.15%(V/V),戊二醛0.2%(V/V),硅藻土6 g/L,菌体质量浓度100 g/L。与游离细胞相比,固定化细胞最适p H由8.0变为8.5,最适温度由35°C变为40°C,p H稳定性和温度稳定性都有所提高。Cu~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)能促进酶活,Zn~(2+)、Fe~(2+)抑制酶活。固定化细胞的有机溶剂耐受性较游离细胞有所提高。动力学分析细胞固定化后Km值变大,底物亲和力降低。利用固定化细胞水解(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯,底物浓度200 g/L,反应20 h,保留构型为S型,得率47.8%,对映体过量值ees为99.4%,重复使用12次后仍保留初始酶活的80%以上。【结论】开发了利用Methylopila sp.cxzy-L013固定化细胞择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的工艺,该工艺具有良好的工业应用前景。     

2018酶工程专刊序言

酶工程是酶学与工程科学融合的综合性科学技术,是现代生物技术的支柱之一。为促进国内酶工程研究的发展,本期"酶工程专刊"集中展现了我国酶工程专家学者在酶工程领域所取得的最新进展。     

定向进化技术的最新进展

筛选是制约酶定向进化改造的瓶颈。为解决这一难题,近年来一系列基于组合活性中心饱和突变(Combinatorial active-site saturation test,CAST)及迭代饱和突变(Iterative saturation mutagenesis,ISM)的半理性设计新方法被开发出来,包括单密码子饱和突变(Single code saturation mutagenesis,SCSM)、双密码子饱和突变(Double code saturation mutagenesis,DCSM)和三密码子饱和突变(Triple code saturation mutagenesis,TCSM)。通过构建"小而精"的高质量突变体文库,对特定靶点进行组合突变,并成功应用于多种生物催化剂的立体/区域选择性及催化活力等多参数的改造。文中综述了近年来定向进化技术的最新进展及其在生物催化剂定向改造中的应用。     

高分子量腈水合酶在大肠杆菌中的表达策略及重组菌的细胞催化

【目的】实现红球菌Rhodococcus rhodochrous J1来源的高分子量腈水合酶H-NHase在Escherichia coli BL21(DE3)中过量表达,以提高菌体总酶活,缩短菌体发酵周期,提高生产效率。【方法】将H-NHase中编码α亚基的基因nhh A和调控基因nhh G上游的核糖体结合位点(Shine-Dalgarno sequence,SD)替换成翻译起始强度更高的异源SD,同时优化各亚基之间间隔序列的长度,并根据大肠杆菌密码子偏好性对目的基因进行优化。通过E.coli重组表达系统过表达优化后的腈水合酶基因。采用离子交换层析对H-NHase进行纯化,并通过凝胶过滤层析确定重组酶的相对分子量。优化了全细胞催化条件,并建立底物恒速流加的细胞催化工艺,模拟了烟酰胺的生产工艺。【结果】H-NHase在E.coli中实现了过量表达。重组蛋白粗酶液的活性为85.5±4.3 U/mg,纯酶比活为234.0±11.7 U/mg,H-NHase相对分子质量为504.5±9.8 k D。细胞催化最适p H为7.5,最适温度为25°C,底物浓度为400 mmol/L。在此条件下,重组菌细胞酶活为256.0±10.4 U/m L,流加工艺最终的产物转化率可达99.9%。【结论】重组H-NHase大肠杆菌细胞生长迅速,发酵周期短,应用此重组菌进行细胞催化可以提高酰胺类物质的生产效率,具有潜在的工业价值。     

猪链球菌7型噬菌体裂解酶Ly7917催化域的裂菌活性

【目的】揭示链球菌噬菌体裂解酶Ly7917催化域CHAP的核心功能域,为进一步改造裂解酶提供理论依据。【方法】通过表达纯化分别从N端截短的Ly7917及从C端截短的Ly CHAP各蛋白,基于平板裂解试验和浊度递减试验,比较各截短蛋白之间的活性差异,以及添加Ca2+后各蛋白的活性变化。【结果】发现催化域蛋白Ly CHAP与Ly7917全酶的活性差异不显著,Ly CHAP的N端序列对其活性影响较大,不宜截短;而C端依次截短后,活性逐渐降低。C端截短20个氨基酸的Ly CHAP1-130,在添加1 mmol/L Ca2+后活性最强。【结论】Ly7917催化域CHAP的核心功能域为1-130 aa,推测其具有Ca2+结合区域,并发现Ly CHAP1-130在Ca2+参与下裂菌活性可媲美Ly7917全酶。预示着Ly CHAP1-130可以替代全酶应用于之后的临床试验。     

国内外生物航煤产业回顾与展望

回顾了近年来国内外生物航煤产业进展,重点综述了通过ASTM D7566(美国材料与试验协会标准)认可的生物航煤生产路线及相应航煤产品性质、油脂原料来源及"十二五"期间国内外生物航煤产业现状,结合笔者自身的研究工作,对未来生物航煤产业发展进行了展望并提出发展建议。     

基于噁唑烷酮的不对称催化合成构建多官能化手性氨基酸类化合物

多官能化手性氨基酸及其衍生物是一类重要的手性药物以及合成手性药的关键中间体,如现在大量用于临床的左甲状腺素、赖诺普利、阿莫西林、缬沙坦、头孢氨苄以及青霉素等。进行多官能化手性氨基酸类化合物的不对称催化合成,可为新型化学药的设计与发现开辟新的视野。噁唑烷酮(Azlactone)被证明是合成四取代氨基酸衍生物的优秀底物。可通过不对称催化手段向其中引入需要的基团,再经多取代的噁唑烷酮直接开环得到一系列的目标化合物。本文主要综述了近年来基于恶唑烷酮的不对称催化反应构建四取代氨基酸类化合物的研究。     

催化示波极谱法测定农作物中的微量铅

1 前言 农作物中铅的含量在很大程度上反映出土壤和成土母岩中铅的水平。铅是一种有毒元素,人体摄入过量的铅,就会导致一系列的病变。因此,农作物中铅的测定对调查和评价环境中铅的污染,估算人畜食入铅的量,研究各类因铅中毒引起的疾病,做到对症下药具有十分重要的意义。本文根据前人的经验研     

催化极谱法测定血清中总铬量

pH=9.3时,铬(Ⅵ)在邻二氮菲——亚硝酸钠体系中,有一灵敏的极谱催化波,检测下限为0.05ppb,在0.05—2.5ppb之间有良好的线性关系。可准确用于定量。Cr(Ⅲ)氧化为Cr(Ⅵ)后,可测得总铬量。