t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达

我们曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000～6000 IU/10~6细胞/24hr。重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。     

一种优化翻译起始效率的方法

本文以人分裂细胞核抗原(PCNA)基因作为目的基因,把包括PCNA基因5′端非翻译区(5′NTR)的24bp和编码38个氨基酸114 bp的顺序插入pTZ19R,构建与LacZ’5′端的融合基因。用寡核苷酸定点突变法在PCNA 5′NTR形成SD顺序,再用PCR法在SD顺序左右两侧分别随机突变6个和7个碱基,使它们与结构基因5′端顺序自发地形成各种可能的翻译起始区(TIR)二级结构。重组质粒转化JM109(DE3),以T7 RNA聚合酶-T7启动子调控转录。对288个重组子的β-gal活性测定表明,不同重组的表达量可相差55倍,其中9个表达量不同的重组子的RNA dot blot证实它们在转录水平无明显表达差异。由此提示,该研究策略和方法能有效地改变目的基因的TIR二级结构和捕获具有高翻译起始效率的表达克隆。     

条锈菌侵染初期小麦初生叶内可翻译mRNA的变化

小麦条锈菌毒性小种及其无毒性突变型侵染初期,是不亲和反应的小麦叶片内可翻译ｍＲＮＡ水平迅速增加,而呈亲和反应叶片的增加幅度小且滞后。同时前者的Ｐｏｌｙ（Ａ＋）－ＲＮＡ水平高于未接种对照,后者低于对照。３２Ｐ标记实验证实不亲和反应叶片Ｐｏｌｙ（Ａ＋）－ＲＮＡ的合成增加早于亲和反应叶片。Ｐｏｌｙ（Ａ＋）－ＲＮＡ体外翻译产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离后,放射自显影图谱显示一些多肽条带的３５Ｓ－Ｍｅｔ相对掺入量有定量差异。     

旋毛虫肌幼虫ES抗原的基因克隆及高效表达

作者对编码旋毛虫肌幼虫ES抗原的部分结构基因进行了克隆、鉴定和表达。用RNA PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫总RNA中反转录并扩增出0．7kh的靶DNA,酶切分析后将其克隆到融合表达载体pEx3lC中。SDS—PAGE电泳表明,含重组子的大肠杆菌能够表达出一分子量为37kDa的融合蛋白(P37),后者占菌体总蛋白的22%以上,并以包含体形式存在于菌体中。经对纯化后表达蛋白的ELlSA检测,证明它能被猪旋毛虫病阳性血清和抗旋毛虫单克隆抗体识别。研究结果揭示,重组蛋白P37对于研制旋毛虫病诊断抗原和免疫抗原具有潜在的应用价值。     

转化生长因子α－绿脓杆菌外毒素融合蛋白TGFα－PE40高效表达质粒的构建和表达

利用基因工程技术,将质粒pYX382用xbaI和EcoRl切下插入的TGFa—PE40融合 基因片段-连接到可表达载体pCB604的XbaⅠ／EcoR Ⅰ位点中,构建成新的重组质粒p2x—TP1。P2x—TP1转化E.coli BL2l感受志菌后,在ⅠPTG诱导下Ⅰpp启动子转录表达TGFα—PE40融合蛋白。表达产物主要以包涵体形式沉积在细胞内。融合蛋白表达量的高低与诱导时的细胞密度,诱导的温度以及培养基有关。在一定范围内与诱导剂的剂量以及诱导时间的长短无关。P2x—TPl重组质粒在工程菌中的表达TGFα－PE40融合蛋白量约为50mg／L。     

体内体外培养下飞蝗雄性生殖细胞的分化

在单一TCl99或GRACE培养液中培养的四龄三天东亚飞蝗(Locusta mtgratoria mani lensis精小管,其精子发生只发育至初级精母细胞期,培养液中添加10%小牛血清或飞蝗精巢匀浆液可促使其发育至次级精母细胞期,添加10%分别取自东亚飞蝗蝗蝻、柞蚕蛹及蓖麻蚕蛹的血淋巴可促进其产生约20%的精子。 蜕皮激素及保幼激素对精子的产生无显著影响。移植培养的精小管在受体飞蝗体内不能发育产生精子,注射20μg/虫蜕皮激素可促使其产生大量精子。完整精巢无需注射蜕皮激素即可在受体飞蝗体内发育产生精子。结果表明,昆虫血淋巴内可能含有促细胞分化类因子,此(类)因子可能无种属特异性,外源蜕皮激素可能对精子发生无直接作用,但精子发生同时需要蜕皮激素和血淋巴因子,精巢本身可能有自己的蜕皮激素来源。     

油菜素内酯促进绿豆上胚轴伸长与蛋白质和核酸合成的关系

用饲喂蛋白质和核酸合成的放射性前体［３ Ｈ］－Ｐｈｅ、［３ Ｈ］－尿嘧啶和［３ Ｈ］－胸腺嘧啶证实了油菜素内酯（ＢＲ）能促进绿豆上胚轴的生长和蛋白质、ＲＮＡ 及ＤＮＡ 的合成。用蛋白质和核酸合成抑制剂（ＣＨ、Ａｃｔ．Ｄ、５－Ｆｕ）进一步探讨它们对上胚轴伸长的抑制作用与蛋白质、ＲＮＡ、ＤＮＡ 和ｍ ＲＮＡ 合成之间的关系。证明了上胚轴的伸长依赖于蛋白质和核酸的合成,尤其是依赖于ｍ ＲＮＡ 的合成。说明ＢＲ是在转录水平上调节基因的表达,进而促进上胚轴的伸长     

花粉高尔基囊泡与牛脑微管的体外结合

把从榛木（Ｃｏｒｙｌｕｓａｖｅｌｌａｎａ Ｌ．）花粉中分离得到的高尔基囊泡与经高度纯化并聚合好的牛脑微管进行体外组合,然后于１．５ ｍ ｏｌ／Ｌ的蔗糖层上进行超离心,对其沉淀物进行ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和电镜负染。结果表明,花粉高尔基囊泡可以结合到牛脑微管上,证明植物花粉的高尔基囊泡与动物细胞的某些细胞器一样,也与细胞骨架的主要组成之一——微管具有结构上的紧密联系。花粉高尔基囊泡与牛脑微管的体外结合能力,受１０ ｍ ｍ ｏｌ／ＬＡＴＰ和０．５ ｍ ｏｌ／ＬＫＣｌ的影响,但不受５ ｍ ｍ ｏｌ／Ｌ ＡＭＰ－ＰＮＰ的影响,说明两者结合可能是通过高尔基囊泡表面与ＡＴＰ有关的某种外周膜蛋白来完成的。     

新型双分子细胞因子融合蛋白研究进展

细胞因子通过相互协调、相互制约在体内发挥着重要的免疫调节作用,利用细胞因子的这一特点,近年来国内外设计并构建了新型的第二代细胞因子,即利用基因工程技术和蛋白质工程技术将两种细胞因子合二为一,使之成为具有多功能的嵌合蛋白新品种,为细胞因子的理论研究及临床应用提供了新的手段与方法.     

P53，Rb和c－myc基因在人脑原发性肿瘤中的转录表达

采用RNA斑点杂交分析,对21例人脑原发性胶质瘤和11例人脑膜瘤中p53,Rb和c-myc基因转录水平的表达进行研究.发现48.4%的肿瘤中p53基因表达减弱,21.9%的肿瘤中Rb基因表达减弱;71.9%的肿瘤中c-myc基因表达增强.在p53基因表达减弱的15例病例中有13例(80%)c-myc基因表达增强.结果表明,p53基因表达减弱和c-myc基因表达增强与人脑原发性肿瘤的发生有关.