利用环介导等温扩增技术快速可视化检测肉褐鳞环柄菇

为了实现对肉褐鳞环柄菇科学、快速的物种鉴定,利用环介导等温扩增（LAMP）技术建立了快速检测肉褐鳞环柄菇的方法,即基于肉褐鳞环柄菇ITS序列设计并验证了一套特异性引物,为进一步缩短反应时间,并增强颜色差异优化了反应体系（Bst DNA聚合酶加入量0.5μL,Mg2+浓度3 mmol/L,HNB浓度180μmol/L,时间45 min,温度65℃）。结果表明:设计的引物特异性强,检测限低（7.56 pg/μL）,可在60 min内通过肉眼观察羟基萘酚蓝的颜色变化判定检测结果。说明利用低成本的LAMP技术能够简单快速、灵敏准确地检测出肉褐鳞环柄菇。     

反转录环介导等温扩增技术对丙型肝炎病毒1b和2a基因型检测

利用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)对中国主要的丙型肝炎病毒(HCV)1b和2a基因型进行扩增。首先,收集临床采样标本,对其进行定量和定性。第二,分别根据HCV 1b和HCV 2a序列的5’非转录区(5’UTR)设计相应的RT-LAMP引物。第三,利用与非特异模板的交叉反应以评价各引物的特异性,利用内切酶酶切产物以进一步保证扩增准确。第四,利用倍比稀释的模板以评价各引物的灵敏性,并用依赖钙黄绿素/Mn2+的可视化方法与电泳结果比较。最后,利用RT-LAMP对所有采样标本进行HCV 1b和HCV 2a两组平行反应,SPSS统计学软件对其实用性初步评价。结果显示,所设计的RT-LAMP引物特异性好,HCV 1b和HCV 2a型产物大小均与预期相同。最低可检测的模板量为100IU/mL,且可视化染色方法电泳结果相一致。统计学软件比较扩增结果表明RT-LAMP与实时荧光定量PCR之间没有统计学差异(P0.05)。综上,RT-LAMP设备简单,操作简便,具有在基层医疗机构的应用前景。     

高通量测序检测金针菇RNAi转化子插入位点及拷贝数

本研究对金针菇Flammulina velutipes的一个RNAi转化子菌株1382R3进行了高通量测序,以本实验室先前获得的野生型W23基因组数据为参考,分析了该转化子的基因插入位点以及拷贝数。转化子菌株1382R3是通过农杆菌介导将fv-hmg1-RNAi载体转化至金针菇菌株并通过PCR检测筛选标记而得到。通过BLAST将转化子测序的reads对外源载体和基因组定位,找到具有基因组序列（GS）和外源载体序列（ES）两种序列的临界reads,并据此使用PERL语言程序成功在转化子1382R3菌株中找到两个插入位点。对两个插入位置的序列分析表明：在插入位点1,T-DNA片段部分插入;在插入位点2,T-DNA全部插入到基因组。两个插入位点都对基因组内源基因的表达造成了一定的干扰。此方法拓宽了高通量测序技术的应用范围,将其运用到遗传转化插入位置和拷贝数的研究中,有利于食用菌的功能基因组及基因工程研究。     

PEG介导的猴头菌遗传转化体系的建立

对猴头菌Hericium erinaceus原生质体制备的各种因素进行比较研究,结果表明,猴头菌原生质体制备的最佳体系为：液体培养5d的猴头菌丝,以0.6mol/L KCl作为稳渗剂,加入含1.0%纤维素酶+1.0%蜗牛酶+1.0%溶壁酶的复合酶,在30℃酶解猴头菌丝3h时,原生质体得率达到3.0×106个/mL。潮霉素敏感性测试表明,猴头菌在PDSA固体培养基上的潮霉素最低筛选浓度为60μg/mL。采用PEG介导的原生质体法,将质粒pBgGI-hph（含有灵芝gpd1-Gl启动子和潮霉素抗性基因hph）转化猴头菌原生质体,经潮霉素初步筛选以及PCR鉴定,表明有4株猴头菌拟转化子的基因组扩增出hph基因;转化子经过多次转接后进行Southern杂交验证,结果表明4个转化子的基因组中均稳定整合了hph抗性基因。     

Waxy基因的RNA沉默使转基因小麦种子中直链淀粉含量下降

通过RNAi策略转化小麦,以降低小麦种子中直链淀粉的含量。小麦中直链淀粉合成的关键酶是颗粒结合型淀粉合成酶（Granule—bound starch synthase l,GBSSI,即WAXY蛋白）,通过RT—PCR方法从小麦种子中分离出Waxy基因。Southern杂交分析表明,在基因组中存在3个Waxy基因。Northern杂交分析显示出在授粉后的小麦种子中检测到Waxy mRNA。利用RNA沉默策略,将Waxy编码区683bp的正向和反向片段以及150bp内含子,连接于表达载体pCAMBIA3300中玉米ubil启动子下游。以扬麦10号授粉后15d的幼胚为外植体,利用农杆菌介导的方法进行转化。通过PCR、RT-PCR和叶片离体褪绿实验鉴定出4株转基因植株。小麦胚乳I2-KI染色和直链淀粉含量测定表明这4株转基因植株直链淀粉含量明显下降。研究结果表明Waxy基因的RNA沉默使转基因小麦种子直链淀粉的含量下降。     

甜菜夜蛾核型多角体病毒在宿主种群中的垂直传播研究

以两种浓度的病毒液感染甜菜夜蛾4龄、5龄幼虫,以研究甜菜夜蛾核型多角体病毒从亲代到子代垂直传递的方式和效率。实验结果表明,该病毒可通过母体介导(卵内、卵表)和父体介导等3种方式传递给子代,造成子代感染。幼虫经口感染后母体介导传递实验表明,病毒垂直传播可引起20%～48%的子代幼虫病死,并能使子代成虫产卵量下降;母体介导传播实验中,以5%福尔马林进行卵表面消毒证实仍有18.8%的幼虫感染病毒死亡,表明了该病毒可经卵内传播,并同时存在着附卵传播;母体介导传递实验还表明病毒对宿主有弱化作用,亲代免于病死的蛹重量减轻,羽化所得雌成虫的产卵量下降,产卵期延长。以交互配对将感染与未感染的雌雄成虫彼此交配,表明雄成虫精子也能垂直传递病毒(父体介导),引起20％～40%子代幼虫感病死亡。成虫经口感染,对所产卵块表面消毒后,仍导致28.6%的子代幼虫死于病毒感染,也表明存在卵内传播。     

生长激素受体及其介导的信号转导

生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)是细胞因子／造血因子受体超级家族的一员。它通过二聚体的形式和生长激素(growth hormone,GH)相结合,然后诱发Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)等细胞因子酪氨酸磷酸化并通过4条不同的途径将信号传入细胞内从而产生一系列的生理效应。现在了解GHR的结构特征、组织分布的基础上,对其介导的信号转导途径作进一步的阐明。     

GFP-mTn融合蛋白对蓝猪耳生活细胞微丝骨架的标记

用农杆菌介导法将嵌合基因GFP-mTn(mTn是微丝结合蛋白Talin的微丝结合域,可以显示活体细胞中微丝的结构)导入蓝猪耳。经激光共聚焦显微镜观察了转基因植株的各种不同组织中融合蛋白的表达和分布情况。在叶片的表皮细胞、保卫细胞、根部的皮层细胞中有融合蛋白的不同程度表达。但仅在保卫细胞中微丝标记状况良好,显示基因表达的组织特异性。经光诱导处于开放态的气孔的保卫细胞微丝呈网状结构,在细胞内无规则分布;经黑暗诱导处于关闭态的气孔保卫细胞中微丝束沿保卫细胞纵轴排列,呈卷曲状分布,并观察到螺旋和环状的微丝结构。在转基因植株的其他部位,例如茎表皮细胞、根毛细胞和花粉粒中,未检测到目的基因的表达。本研究获得的转基因植株为研究气孔运动过程中微丝动态变化提供了有用的材料。     

根癌农杆菌介导的白腐丝状真菌——黄孢原毛平革菌的转化

利用农杆菌介导的方法成功地对黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）进行了遗传转化。将含有潮霉素磷酸转移酶融合基因的双元质粒pCH61300转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）208中,然后用该转化菌分别感染黄孢原毛平革菌的分生孢子和原生质体,获得16株可能的转化子,经复筛,共获得6株潮霉素抗性水平为100μg/mL的稳定转化子,分生孢子和原生质体的转化频率没有明显差别。PCR检测结果显示,抗性基因已导入黄孢原毛平革菌细胞中;Southern杂交表明,TDNA以单拷贝形式整合到黄孢原毛平革菌基因组中。其中的一个转化子菌落形态与原野生型菌株相比有所不同,菌丝稀薄,分生孢子较少。利用分生孢子转化更为简便易行,无需特殊的设备和制备原生质体,此方法为深入开展该菌的遗传转化研究奠定了基础。     

花生基因工程

建立花生遗传转化和高效植株再生系统是花生基因工再生技术和基因转化体系的完善,已获得抗病、抗虫和提高品质的转基因花生植株,取得了突破性进展.农杆菌介导法和微弹介导法是花生基因工程的主要方法.