利用基于CRISPR-Cas9 的基因编辑技术对miR-29a在GT1-7 细胞中进 行基因敲除

目的:本文利用CRISPR-Cas9技术在GT1-7细胞中对miR-29a基因进行基因编辑,用于构建miR-29a基因敲除GT1-7细胞模型。方法:通过构建Cas9稳转的GT1-7细胞株并转染sgRNA质粒用于在靶向miR-29a基因区域引发突变。然后构建EGFP与sgRNA共表达质粒并转染Cas9稳转GT1-7细胞,利用流式细胞仪富集表达绿色荧光蛋白的阳性细胞和分选阳性单克隆细胞。最后利用实时荧光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR)对富集细胞和单克隆细胞进行miR-29a表达量检测。结果:T7E1检测结果显示CRISPR-Cas9系统有效地在miR-29a基因区域引发了突变。荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,富集后阳性细胞miR-29a的表达量整体下降了50%左右(P0.05)。此外,通过流式筛选获得了一个纯合miR-29a基因敲除细胞克隆,与对照组相比,其miR-29a的表达量下降了75%左右(P0.05)。结论:本文建立了一种有效编辑GT1-7细胞基因的方法,并采用该方法构建了miR-29a稳定敲除细胞模型。     

间充质干细胞治疗糖尿病心脏病研究进展及其机制

糖尿病心脏病(diabetic cardiomyopathy,DCM)患者心脏病变弥漫、病变程度严重,患病率与死亡率逐年上升,缺乏有效的治疗手段,找到其他的治疗途径已成为一项重要内容。有研究发现,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)作为一种具有多分化潜能的细胞,能够通过多种机制作用于DCM的病理改变,提高心脏射血分数、改善心室重塑,是一种富有前景的治疗手段,本文着重就DCM的发病机制、MSCs对DCM的治疗机制及效果做一综述,为MSCs在DCM治疗中的应用提供重要的临床前实验依据。     

糖尿病血管平滑肌细胞增殖与线粒体关系的研究进展

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是严重危害人类健康的全身性代谢疾病,常发生血液流变学、微循环和细胞代谢的紊乱,导致缺血、缺氧和组织水肿,进而引起血管和神经病变。血管病变常常是糖尿病病人致死、致残的主要原因。血管平滑肌细胞的增殖及表型改变是糖尿病引发动脉粥样硬化性疾病的显著特征,而线粒体在血管平滑肌细胞的增殖过程中起重要作用。因此,探讨糖尿病血管平滑肌细胞与线粒体的关系及机制为糖尿病血管性疾病的治疗提供重要的理论基础,有利于基础研究向临床试用药物研究的转化。     

VEGF-A在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的:探讨血管内皮生长因子A(VEGF-A)在食管鳞状细胞癌中的表达及临床意义。方法:收集2009年1月-2010年12月收治的45例食管鳞状细胞癌患者临床资料及病理标本,应用免疫组织化学法检测肿瘤组织VEGF-A表达及微淋巴管密度(MLVD),分析VEGF-A表达与食管鳞癌患者临床病理资料、MLVD及与患者生存期限的关系。结果:1有淋巴结转移的患者VEGF-A表达阳性率为66.67%,明显高于无淋巴结转移患者的38.10%(P0.05);2 VEGF-A阳性食管鳞状细胞癌患者MLVD为(8.35±2.45)明显高于阴性患者的(5.32±1.44),(P0.05);3VEGF-A阳性食管鳞状细胞癌患者3年存活率为41.67%明显低于阴性患者的61.90%(P0.05)。结论:VEGF-A表达在确定早期食管鳞状细胞癌淋巴结转移方面具有一定的应用价值,可以作为评价预后的有效指标。     

SCARF1 在人THP-1 单核源性巨噬细胞抗烟曲霉菌刺激中的作用

目的:运用干扰腺病毒沉默THP1细胞中SCARF1基因研究其在体外抗烟曲霉中的作用。方法:用灭活的烟曲霉分生孢子(1×105 CFU/m L)于不同时间点处理THP-1细胞,RT-PCR分别检测SCARF1和TNF-αm RNA的表达;将Ad-si RNA-SCARF1转导细胞24 h后给予烟曲霉孢子刺激24 h,通过RT-PCR法检测细胞中TNF-αm RNA表达,Western blot法检测细胞中SCARF1表达以及NF-κB通路相关信号分子的活性。结果:RT-PCR证实烟曲霉孢子刺激能时间依赖性增强THP1细胞中SCARF1和TNF-α表达;Western法证实与Ad-GFP组比较Ad-si RNA-SCARF1组SCARF1的表达量显著降低(P0.05),沉默效率为71%;与Ad-GFP组比较,Ad-GFP+Af组NF-κB亚单位p65的磷酸化水平明显升高(P0.05),在Ad-si RNA-SCARF1+Af组,磷酸化p65的产生明显减少,SCARF1沉默后细胞因子TNF-α的分泌明显减少。结论:烟曲霉孢子刺激能诱导巨噬细胞SCARF1的表达增加,诱导信号分子NF-κB的活化,导致相应的细胞因子分泌增加,从而在巨噬细胞抗烟曲霉中发挥作用。     

小鼠去细胞拟胚体对小鼠Lewis肺癌细胞体内生长的影响

目的:阐明小鼠去细胞拟胚体对小鼠Lewis肺癌细胞在体内生长的影响。方法:先制备来源于小鼠胚胎干细胞的拟胚体,然后用SDS去细胞处理。实验分成3组:小鼠Lewis肺癌细胞与去细胞拟胚体培养组,癌细胞与Matrigel培养组和单纯癌细胞组(每组n=12)。培养3天后注射入裸鼠体内,观察肿瘤生长情况。28天取出瘤体,Ki67和CD31免疫组化染色(n=12)检测细胞增殖和肿瘤微血管密度(MVD),Western blot检测组织Paxillin,E-cadherin和β-actin水平(n=6)。结果:去细胞拟胚体组肿瘤生长明显较单纯细胞组和Matrigel组慢。去细胞拟胚体组Ki67指数((17.1±2.6)%)明显小于单纯细胞组((34.5±4.7)%)和Matrigel组((48.4±8.6)%)(P0.05);去细胞拟胚体组的MVD(18.7±3.6个/mm2)明显小于单纯细胞组(32.1±6.4个/mm2)和Matrigel组(42.6±7.1个/mm2)(P0.05)。Western blot结果提示去细胞拟胚体组的Paxillin表达小于单纯细胞组和Matrigel组(P0.05),而E-cadherin表达大于单纯细胞组和Matrigel组(P0.05)。结论:小鼠去细胞拟胚体对小鼠Lewis肺癌细胞在体内有明显的促分化作用。     

肝细胞核因子在2型糖尿病发生中的作用研究新进展

肝细胞核因子(Hepatocyte nuclear factors,HNFs)是一类分布在肝、胰、肠、肾等多个组织器官,调节肝脏内基因特异性表达的一类转录因子。其主要亚型为HNF1、HNF3、HNF4和HNF6等,这些转录因子相互作用构成的复杂调控网络。2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus,T2DM)的基本病理生理机制是胰岛素抵抗及胰岛β细胞损伤,最终导致高血糖。近年来的研究表明,HNFs在胰岛素抵抗及胰岛β细胞损伤中发挥关键的调控作用。本文对HNFs在T2DM发生中的胰岛素抵抗及胰岛β细胞损伤作用研究新进展作以回顾性综述,旨在为认识T2DM发病机制及提出防治策略提供理论基础。     

调节性T 细胞在发热结缔组织病患者外周血中的表达及临床意义

目的:研究Treg细胞在发热CTD患者外周血表达对结核感染的诊断价值。方法:对103例发热CTD患者进行T-SPOT.TB试验,将39例阳性者设为实验组-1,进行抗结核治疗,将64例阳性者设为实验组-2,另选取40例健康者作为对照组,检测三组外周血CD4+CD25+Treg细胞、Foxp3基因、IL-10、TGF-β的表达。结果:实验组CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞占CD4+T比例高于对照组(P0.05),实验组-1治疗前外周血CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞占CD4+T比例高于实验组-1治疗后、实验组-2(P0.05);实验组TGF-β表达量低于对照组(P0.05),实验组-1治疗前低于实验组-1治疗后及实验组-2(P0.05);实验组-1治疗前IL-10表达量低于实验组-1治疗后、实验组-2及对照组(P0.05)。结论:CD4+CD25+Foxp3 Treg细胞在发热CTD伴有结核感染患者外周血中的表达升高,其变化可作为结核感染诊断的辅助性指标。     

柚皮中的有效成分对人子宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨柚皮素或柚皮苷对人子宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响。方法柚皮素或柚皮苷(0.250、0.125、0.063g/L)作用于人子宫颈癌Hela细胞后,MTT比色法检测Hela细胞增殖活性和半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50);流式细胞术检测柚皮素对Hela细胞凋亡的影响。结果柚皮素能抑制Hela细胞增殖,且呈剂量和时间依赖性,24、48和72hIC50值分别为0.24、0.11和0.07g/L;柚皮苷无抑制Hela细胞增殖的作用。柚皮素组(0.22g/L、0.11g/L、0.05g/L,作用48h)人子宫颈癌Hela细胞凋亡率高于对照组,差异有统计学意义(P=0.000239681,P=0.00012746,P=5.09328E-05,P0.01)。结论柚皮中黄酮类提取物具有抑制人子宫颈癌Hela细胞增殖作用,其中柚皮素作用明显,部分作用机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关。柚皮苷无抗人子宫颈癌作用。     

地高辛标记DNA探针杂交法检测Vero细胞DNA残留量的适用性验证及应用

目的对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行适用性验证及应用。方法对地高辛标记DNA探针杂交法检测人用狂犬病疫苗(Vero细胞)DNA残留量进行特异性、灵敏度及稳定性验证,并应用该方法检测3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)的DNA残留量。结果地高辛标记探针的标记效率为0.1 pg。验证结果显示探针与非同源DNA无杂交;最低检测限度为1 pg;探针在-20℃放置7个月后,检测灵敏度仍可达到1 pg;3批人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中残留DNA含量均符合《中国药典》规定质量控制标准。结论地高辛标记DNA探针杂交法特异性、灵敏度好,结果稳定,适用于人用狂犬病疫苗(Vero细胞)中Vero细胞DNA残留量的检测及疫苗生产过程和其成品的质量控制,对其他以Vero细胞为基质的病毒性疫苗质量控制具有借鉴意义。