中华绒螯蟹水通道蛋白11基因克隆及表达分析

为研究水通道蛋白11基因(AQP11)在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)生长蜕壳过程中的功能作用,采用RACE技术克隆获得中华绒螯蟹水通道蛋白11基因cDNA全长序列.该序列总长为1 746bp,5'端和3'端非编码区分别为463 bp和476 bp,开放阅读框为807 bp,推测编码268个氨基酸,预测分子量29.46 kDa,理论等电点为5.38.生物学信息分析表明,AQP11含有4个跨膜区(第62～84,第159～181,第194～216,第231～250)和2个NPV单元,属于稳定蛋白;同源性和进化树分析表明,中华绒螯蟹AQP11氨基酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的同源性最高(82.0％),与凡纳滨对虾的聚为一支,与甲壳动物的亲缘关系最近.实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的检测显示,AQP11基因在中华绒螯蟹各组织中均有表达,其中在肠道中表达量最高,其次是脑、肌肉和胸神经节,在肝胰腺、鳃和血中表达量最低.研究发现,AQP11基因在中华绒螯蟹肠道中的表达呈现,在蜕壳间期(C期)和蜕壳前期(D期)过程中表达量均较低,在蜕壳期(E期)表达量开始上升,蜕壳后期(AB期)表达量不变.AQP11基因在肌肉中的表达呈现,蜕壳间期(C期)表达量低,蜕壳前期(D期)表达量开始上升,蜕壳期(E期)达到峰值,随后到蜕壳后期(AB期)下降.研究结果表明,中华绒螯蟹AQP11基因在其蜕壳过程中发挥着重要的作用.     

中华鬣羚行为谱及PAE编码系统的建立

栖息地破碎化、人为干扰等因素影响着中华鬣羚(Capricornis sumatraensis)的生存。目前, 中华鬣羚的行为研究还比较匮乏, 因此有必要构建中华鬣羚的行为谱及PAE (posture-act-environment)编码系统, 以期促进其基础行为资料的完善, 为深入开展科学研究和保护工作奠定基础。本文旨在: (1)参照国内常用的动物行为编码方法, 以“姿势-动作-环境”为轴心, 建立中华鬣羚的行为谱及PAE编码系统, 并随机抽取20%的中华鬣羚视频作为检测样本, 对行为谱的实际使用效果进行测试。(2)对中华鬣羚的行为数据进行统计并通过计算行为多样性指数, 分析各特定年龄组间的行为多样性差异, 检验特定年龄组与行为多样性指数间的相关性。结果显示: (1)通过区别和归类中华鬣羚的10种姿势、80种动作、9种环境、78种行为, 首次建立了中华鬣羚的行为谱及PAE编码系统。经测试, 该行为谱能够客观地对中华鬣羚行为进行识别和归类。(2)与亚成体和幼体相比, 中华鬣羚成体特定行为类型的行为多样性指数(A_variable)、绝对行为多样性指数(A)、相对行为多样性指数(r)和校正行为多样性指数(r-variable)均为最高; 中华鬣羚亚成体特定行为类型的行为多样性指数(A_variable)、绝对行为多样性指数(A)、相对行为多样性指数(r)介于成体和幼体之间; 中华鬣羚幼体的特定行为类型的行为多样性指数(A_variable)、绝对行为多样性指数(A)和相对行为多样性指数(r)最低, 校正行为多样性指数(r-variable)高于亚成体。(3)中华鬣羚行为谱可用于其行为学研究, 今后应获取繁殖行为的图像数据, 更新行为谱及PAE编码系统。(4) 3个特定年龄组中华鬣羚的各行为多样性指数之间差异不显著(F = 0.013, P = 0.987), 从幼体到成体, 中华鬣羚的特定行为类型的行为多样性指数(A_variable)、绝对行为多样性指数(A)和相对行为多样性指数(r)随年龄的增大呈递增趋势。综上所述, 我们应深入研究中华鬣羚行为学, 为其保护工作提供科学支撑。     

2010-2020年中华穿山甲在中国的发现记录及保护现状

中国是中华穿山甲(Manis pentadactyla)历史分布区面积和野生种群数量最大的国家。中华穿山甲曾广泛见于我国长江以南各省, 但20世纪中期以来, 由于其甲片被作为贵重的中药材原料, 加之地下野味市场的需求, 大量非法捕猎使得我国野生穿山甲经历了剧烈的分布区缩减和种群下降。目前, 中华穿山甲已被列为我国一级重点保护野生动物, 在IUCN红色名录中被评估为极危(CR)等级。中华穿山甲分布范围广、种群密度低、活动隐秘、调查难度大, 摸清其野外分布现状是当前穿山甲研究与保护中的首要任务。为此, 本研究通过检索2010-2020年间全国范围内中华穿山甲的发现记录, 统计中华穿山甲的目击数量、空间分布以及后续状态, 制作物种分布地图, 并与历史分布情况进行对比, 以评估其野生种群的分布现状与分布区变化。2010-2020年共在11个省级行政区收集到中华穿山甲确认记录142条, 主要集中于大陆华东地区及台湾岛, 台湾、浙江、广东三省记录位点数占全部位点数的67.6%; 相较其历史分布区, 西南、华南地区近年来野外确认较为匮乏。近10年来我国的中华穿山甲记录呈逐渐增多趋势, 86%被发现的实体穿山甲得到救助、放归或未被干扰。本研究结果表明, 目前中华穿山甲在我国, 尤其是华东及台湾地区, 仍具有一定数量的野生种群分布, 且近年来民众对于穿山甲的认知和保护意识有了较大提高。 然而, 现有调查和资料仍不足以对该物种进行全面的现状评估, 亟需加强对我国野生穿山甲种群的调查、监测和保护。     

中华蜜蜂AcNPC2b的原核表达和鉴定

[目的]中华蜜蜂Apis cerana cerana(简称中蜂),其胞内胆固醇转运体AcNPC2a能够识别并结合几种微生物的细胞壁,AcNPC2存在于该蜂触角,参与嗅觉通讯,关于AcNPC2b的功能尚未见报道.[方法]通过对中华蜜蜂AcNPC2b基因进行原核表达,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗血清;利用荧光定量PCR和免疫印迹检测AcNPC2b的转录活性及蛋白水平,通过微生物结合测定对AcNPC2b的功能进行探索.[结果]中蜂AcNPC2b含有信号肽和ML结构域,具有3个二硫键,与果蝇Drosophila melanogaster DmNPC2b聚为一个亚枝.荧光定量qRT-PCR检测发现,感染中蜂囊状幼虫病毒(Chinses sacbrood virus,简称CSBV)的幼虫体内AcNPC2b基因的表达呈现出先微弱下调再持续上调的趋势.获得了约16ku的重组蛋白AcNPC2b并制备了多克隆抗体,免疫印迹结果表明,中蜂AcNPC2b蛋白在工蜂头、胸与中肠中的表达量最高,触角、马氏管与脂肪体中次之.AcNPC2b蛋白在正常与感染CSBV病毒的中蜂幼虫中均有表达,且在感染CSBV的中蜂幼虫中有微弱上调.重组蛋白AcNPC2b微生物结合测定实验结果显示中蜂AcNPC2b重组蛋白均能与活的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌以及白僵菌结合.[结论]正常与感染CSBV病毒的中蜂幼虫体内AcNPC2b基因转录水平和AcNPC2b蛋白的表达含量存在差异,重组蛋白AcNPC2b具有识别并结合病原菌的能力,为后续深入研究AcNPC2b蛋白的分子功能奠定了一定理论基础.     

西伯利亚蝗抗菌肽基因的克隆及表达特性研究

[目的]扩增西伯利亚蝗Gomphocerus sibiricus抗菌肽(attacin)基因,并对其进行生物信息学分析,同时分析西伯利亚蝗不同组织中抗菌肽基因的差异表达.[方法]基于RACE技术从西伯利亚蝗中克隆得到抗菌肽,利用生物信息学软件对西伯利亚蝗抗菌肽的一级结构、二级结构、三级结构、系统进化和亚细胞定位进行分析.采用实时荧光定量PCR技术检测了西伯利亚蝗抗菌肽基因在马氏管、中肠、后肠、脂肪体和唾液腺中的相对表达量.[结果]克隆获得的抗菌肽基因的开放阅读框为282 bp,编码93个氨基酸,其编码蛋白预测理论分子量为9.98 ku,等电点为9.26.抗菌肽氨基酸序列中存在信号肽序列.基因定量分析显示,抗菌肽基因在西伯利亚蝗的中肠中表达量最高.[结论]attacin在西伯利亚蝗成虫不同组织中差异表达,提示其消化道在防御病原微生物的入侵中起着重要的作用.     

中华蜜蜂气味受体基因AcerOR58的序列与时空表达分析

[目的]通过分析中华蜜蜂Apis cerana cerana气味受体基因AcerOR58编码蛋白的理化性质、结构特征,明确AcerOR58时空表达特性,为该基因后续的功能研究奠定基础.[方法]利用多种生物信息学软件预测分析AcerOR58序列及其编码蛋白的结构特性,采用邻接法构建系统进化树.利用实时荧光定量PCR技术分析AcerOR58在不同发育阶段工蜂触角及采集蜂不同组织的表达差异.[结果]AcerOR58基因的开放阅读框(ORF)长1 230 bp,编码409个氨基酸,成熟蛋白分子量为47.147 ku,理论等电点8.46,无信号肽,含有6个跨膜结构且N端位于胞内,31个潜在的磷酸化位点,在第80-405位氨基酸之间存在一个昆虫气味受体家族7tm_6 superfamily保守结构域.AcerOR58与西方蜜蜂Apis mellifera的AmelOR58亲缘关系最近,核苷酸序列一致性高达96.67％,氨基酸序列一致性高达97.31％.AcerOR58在采集蜂(15-25日龄)阶段的表达量较高,且在触角中的表达量极显著高于其他组织(P＜0.01).[结论]AcerOR58具有昆虫气味受体的结构特征,该基因特异性高表达于中华蜜蜂采集蜂触角中,推测其功能与识别外界蜜粉源的花香气味物质有关.     

中华大蟾蜍TAGLN2 cDNA的克隆与其组织分布

为研究蟾蜍(Bufo)基原的中药材中的多肽类有效成分,开展从日本蟾蜍(B.japonicus formosus)皮肤cDNA质粒文库中筛选蛋白编码基因的工作.由于后续拓展蟾蜍药用价值的研究中需要大量的实验材料,开始以中华大蟾蜍(B.gargarizans)皮肤第一链cDNA为模板,克隆其相关基因的工作.通过DNA聚合酶链式反应获得编码转胶蛋白-2(transgelin2,TAGLN2)的转录子(GenBank登录号为KF432856).该cDNA全长1 207 bp,其5′、3′端非翻译区域和开放阅读框分别为16 bp、597 bp和594 bp,编码由197个氨基酸残基组成的蛋白质,与日本蟾蜍的TAGLN2(GenBank登录号为AGQ03775.1)相比,仅一个氨基酸发生替换,与人的同源性为82%,与其他动物的同源性介于70%⁷5%.RT-PCR组织分布检测表明TAGLN2在所检测的中华大蟾蜍各器官中均有表达,在肺、肝和肾中表达量较多.这些研究结果为后续中华大蟾蜍TAGLN2的生物学功能研究以及相关药物研发提供基础数据.     

金沙江中上游中华金沙鳅(Jinshaia sinensis)产卵场的发现及意义

该研究分别于2012年4月、7—8月及11月针对云南省金沙江梨园电站影响区域的鱼类早期资源进行了3次监测。并于2012年7—8月对云南省玉龙县大具乡大具渡口金沙江的监测中,发现中华金沙鳅(Jinshaia sinensis)卵汛两次,分别为8月1日8:00—4日10:00和8月9日23:00—13日6:00。结果发现,中华金沙鳅鱼卵卵径3.37~4.41 mm,平均3.89 mm,自然受精率为91.5%,模拟培养出膜率为97.1%,畸形率为2.2%;产卵场共3处,分别位于云南省玉龙县龙蟠镇、黎明乡和巨甸镇;三处产卵场两次产卵共计~1.49×107ind.。此次产卵场的发现是对以往中华金沙鳅生物学资料的重要补充,对电站建设背景下金沙江鱼类资源的保护具指导意义。     

东亚飞蝗细胞色素P450基因的克隆及表达分析

本文克隆了东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)细胞色素P450(cytochrome P450)基因全长,表达重组蛋白,并对其可溶性进行了分析。通过提取东亚飞蝗总的RNA,反转录成cDNA,设计特异性引物,PCR克隆东亚飞蝗细胞色素P450基因,将测序正确的目的片段克隆至原核表达载体pET-28a中,在大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测重组蛋白表达结果。结果表明:东亚飞蝗细胞色素P450基因开放阅读框全长为1 551 bp,编码516个氨基酸,与GenBank中已登录的东亚飞蝗细胞色素P450基因(HM153426)的同源性为99%,重组质粒pET-28a-P450在E.coli Rosetta中获得高效表达,重组蛋白相对分子质量(Mr)约为53 000,主要以包涵体的形式存在。     

内蒙古天然草原不同放牧压力下亚洲小车蝗的食性及营养生态位（英文）

植物表皮蜡质中的饱和链烷作为内源指示剂广泛用于评价放牧家畜的食性和食量, 但用于天然草原蝗虫食性的评价研究较少。为了探讨天然草原蝗虫的食性及其生态位变化, 本研究以内蒙古天然草原为研究对象, 于2003年7-8月沿降水梯度选择3种典型植物群落（小针茅Stipa klemenzii、 羊草Leymus chinensis和大针茅Stipa grandis群落）, 在每个植物群落不同放牧压力下小区随机做20个植被样方, 样方内植物齐地面刈割, 测定其地上生物量和物种多样性, 取主要植物种测定其链烷模式, 同时采集放牧小区优势蝗虫种亚洲小车蝗Oedaleus asiaticus的粪便, 测定其链烷模式, 运用链烷技术评价蝗虫的食性及其营养生态位。结果表明： 不同植物群落中优势牧草种类及其比例不同, 其链烷模式存在种间差异, 链烷技术可以评价亚洲小车蝗的食性。亚洲小车蝗的食性在不同植物群落及不同放牧压力下存在显著的差异, 在羊草和大针茅群落中, 亚洲小车蝗是禾草采食者, 主要采食羊草和糙隐子草Cleistogenes squarrosa, 且与绵羊的营养生态位重叠指数较低, 分别为0.0619和0.0172; 在小针茅群落中亚洲小车蝗是杂类草采食者, 主要采食无芒隐子草Cleistogenes songorica、 猪毛菜Salsola collina和小针茅, 且与绵羊的营养生态位重叠指数较高, 达到0.1815。因此, 放牧不仅改变了群落的植物种类组成, 而且直接影响了亚洲小车蝗的食物组成, 二者对食物资源利用存在一定程度的竞争。