壳聚糖介导CrmA基因治疗小鼠肝纤维化的研究

目的:探讨壳聚糖介导的CrmA对小鼠肝纤维化的治疗效果,以期为肝纤维化的基因治疗提供实验基础。方法:清洁级的75只雄性小鼠随机分为正常组、模型组、壳聚糖介导的CrmA组、壳聚糖介导的空载体组、壳聚糖组,每组15只。应用30%四氯化碳橄榄油溶液3 ml/kg腹腔注射制备肝纤维化小鼠模型。治疗8周后,眼眶取血,检测血清的肝功能指标,并取肝组织做HE染色,观察各组小鼠肝脏的病理形态,Real Time PCR检测肝组织IL-1β、α-SMA、TGF-β1、TIMP-1表达量。结果:与模型组小鼠相比,壳聚糖介导的CrmA组小鼠的肝纤维化程度减轻,ALT、AST显著降低(P0.01),肝组织IL-1β、α-SMA、TIMP1、TGF-β1的表达明显减少(P0.05),而模型组、壳聚糖介导的空载体组和壳聚糖组均无显著性差异。结论:壳聚糖介导的CrmA能有效减轻肝纤维化小鼠的肝脏损伤和纤维化程度,为基因治疗肝纤维化提供了一种潜在的新思路和方法。     

干扰HD-ZipⅢ家族成员OsHox33的表达加速水稻叶片的衰老

HD-ZipⅢ基因家族成员在植物生长发育中起重要作用,主要涉及调控植物胚的发育模式、茎顶端分生组织的形成、叶片极性的形成、维管系统的发育等多个方面.尤其在植物叶片的发育中起重要作用.尽管HD-ZipⅢ家族成员在陆生植物中高度保守,但基于拟南芥多重突变体的遗传分析揭示了HD-ZipⅢ家族的功能在进化过程中已有所分化.本文报道了一个HD-ZipⅢ家族成员OsHox33,并分析了其功能,研究结果表明,其在水稻叶片衰老中起重要作用.为了揭示OsHox33的功能,本研究构建两个特异的RNAi载体(一个干涉片段来自OsHox33的5′端,另一个来自OsHox33的3′非翻译区)干扰OsHox33的表达,结果表明,两个载体的转基因植株都展示了叶片早衰的相似表型,表明干扰OsHox33的表达加速了水稻叶片的衰老.pOsHox33::GUS及RT-PCR分析表明,OsHox33在水稻幼嫩的器官中有较高的表达,尤其在茎顶端分生组织、居间分生组织及愈伤等幼嫩组织有较高的表达.不同时期叶片实时定量PCR分析表明,OsHox33在水稻幼叶中有较高的表达,但在衰老叶片中表达降低.另外,不同时期叶片叶绿体电子显微镜超微结构显示,OsHox33 RNAi转基因植株加速了叶绿体结构的降解,与OsHox33 RNAi转基因植株的表型相一致.基因表达调控结果显示,OsHox33可以调控水稻叶片衰老特性基因GS1和GS2的表达,干扰OsHox33的表达降低了GS1的表达,但增加了GS2的表达.本文对于HD-ZipⅢ家族在植物生长发育中的功能提供了新的理解.     

植物抗病毒分子机制

在与植物病毒的长期斗争中,植物进化出多种抗病毒机制,其中RNA沉默和R基因介导的病毒抗性是最受人们关注的两种机制.一方面,RNA沉默是植物抵抗病毒侵染的重要手段.植物在病毒侵染过程中可形成病毒来源的双链RNA,经过DCL蛋白的切割、加工形成sRNA,与AGO蛋白结合形成RISC指导病毒RNA的沉默,用于清除病毒.相应地,病毒在与植物的竞争中进化出RNA沉默抑制子,抑制宿主RNA沉默系统以逃避宿主RNA沉默抗病毒反应,增强致病能力.另一方面,植物也进化出R基因介导植物对包括病毒在内的多类病原的抗性.R蛋白直接或间接识别病毒因子,通过一系列的信号转导途径激活植物防御反应,限制病毒的进一步侵染.对植物抗病毒的研究有助于人们对植物抗病分子基础的理解,有重要的科学意义和潜在应用价值.本文综述了植物抗病毒分子机制的重要进展.     

定量蛋白质组学分析ClpS在分枝杆菌耐药中的功能

ClpS是原核生物蛋白质降解复合物ClpAPS的重要组成成分,它可以识别某些特定的氨基酸序列并将其呈递给ClpAP以促进其降解。同时,ClpS也抑制了其他蛋白质底物的降解。本研究通过在耻垢分枝杆菌中过度表达ClpS,发现所构建的重组菌株提高了利福平的抗药性。应用定量蛋白质组学技术,我们系统地分析了过度表达ClpS对于细菌蛋白质组的影响,并推测出细菌抗利福平的分子机制:ClpS促进稳态的调整、促进药物沉降以及加速药物代谢。本研究首次通过改变细菌降解复合物的相关蛋白的表达增加细菌的抗药性,并证明蛋白质组学技术是细菌的抗药性研究以及耐药株筛选的重要工具。     

肝星型细胞分离方法和功能研究进展

肝星型细胞(Hepatic stellate cells,HSCs),又叫储脂细胞(Fat-storing cells,FSCs)或脂肪细胞(lipocytes),是肝脏固有的非实质细胞类型之一,存在于狄氏腔内,以脂滴的形式储存人体维生素A总量的50%–80%。原代HSCs分离方法,目前主要集中于密度梯度离心法结合离心淘洗、HSCs高侧向角的流式分选法、紫外激发的自发荧光或特异性抗体标记的流式细胞术等,将为HSCs生理和病理研究提供坚实的基础。近年来,HSCs的研究蓬勃发展,合作领域不断拓宽。生理状态下,HSCs处于静息状态,合成细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)并维持其稳态,同时广泛摄取和储存维生素A,并具有调节肝细胞再生的功能;而病理状态下,HSCs在肝损伤和持续性刺激条件下被激活,增殖活性明显增强,脂滴减少或消失,ECM合成也明显增加,具有收缩性,同时分泌多种促炎因子和粘附分子,并向肌成纤维细胞转变,表明HSCs的活化是肝纤维化发生发展过程中的关键环节之一。有关HSCs的分离和功能研究一直是肝脏细胞学和肝脏病理学研究的热点之一。文中我们将系统总结和探讨HSCs的分离方法和改进策略,及其功能研究进展和具有潜在价值的研究方向。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B抑制IFN介导的抗病毒反应

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)非结构蛋白NS4B的功能仍不很清楚。本实验旨在研究NS4B对干扰素介导的抗病毒反应的影响。建立稳定表达NS4B的细胞系后,用空斑实验研究NS4B在不同浓度的IFN_α下对水泡口炎病毒(VSV)的影响,利用代表2308个信号传导相关的基因的微点阵研究其对细胞基因表达的影响,和流式细胞仪分析IFNGR1的荧光强度。结果显示HCV_NS4B能微弱地抑制IFN_α介导的抗病毒反应,可能原因是HCV_NS4B抑制一些与免疫反应相关的基因的表达,特别是与IFN_γ信号传导有关的基因。因此,NS4B对HCV耐受干扰素治疗起一定的作用。     

细胞培养技术在植物抗性生理研究领域中的应用

本文综述了近10年来有关利用细胞培养技术所进行的抗性生理领域的研究成果,包括在培养过程中植物细胞对外界胁迫的反应、有关利用细胞培养技术研究植物的抗逆性反应,以及植物抗逆性的理论在实际中的应用。大量的实验证明,细胞培养技术在植物抗逆性研究领域具有广阔的应用前景。     

管蝶法测定苏云金杆菌上清液中增效物质含量的研究

以草生欧文氏杆菌LS005为指示菌,用管蝶法测定苏云金杆菌KN－11发酵液中增效物质的相对浓度。结果表明管蝶法和生物测定法在测定增效物质的代谢曲线有较好的一致性,均表明,菌株KN－11的增效物质城营养体时（约9h）开始产生,到芽孢初步形成时（约20h）已达到最高值的80％以上,之后是一个缓慢的积累过程。     

23S rRNA甲基转移酶RrmJ促进细菌50S亚基后期组装

核糖体是所有细胞中负责蛋白质合成的分子机器。它自身在细胞内的组装成熟过程受到严密调控,需要诸多组装因子的参与。RrmJ是原核生物中一类保守的甲基转移酶,能够甲基化修饰核糖体上肽基转移酶中心（peptidyl transferase center, PTC）内A环的U2552位点。敲除rrmJ基因的大肠杆菌表现出显著的生长缺陷及50S亚基组装前体的累积,因而RrmJ在50S亚基组装中具有重要作用。本研究对细菌生长实验与核糖体图谱分析表明,回补表达RrmJ的质粒对于ΔrrmJ菌株生长缺陷有显著改善,50S前体累积现象也得到有效缓解。通过共沉淀实验证明,RrmJ与ΔrrmJ菌株中提取的50S前体结合能力显著强于缺失型或野生型菌株中纯化的成熟50S;当加入S-腺苷甲硫氨酸时,该酶与50S前体结合能力显著下降。冷冻电镜三维重构数据进一步阐明,缺失型菌株50S前体主要停滞在组装晚期两个PTC区域成熟程度不同的特定时段。综合上述结果表明,U2552位点的修饰发生在50S亚基组装晚期特定阶段,这一事件不仅会加速A环的RNA螺旋折叠,另有可能促进附近PTC区域结构成熟。     

简单节杆菌3-甾酮-△1 -脱氢酶基因的克隆表达及定点突变研究

目的:将来源于简单节杆菌的3-甾酮-△~1-脱氢酶(3-ketosteroid-Delta(1)-dehydrogenase,KSDD)在大肠杆菌中进行表达,获得具有活性的脱氢酶;利用计算机预测KSDD的三级结构,并通过定点突变确定酶的关键位点以期优化脱氢酶的活性及性质。方法:克隆简单节杆菌编码KSDD的基因ksdd构建原核表达载体,以Escherichia coli BL21(DE3)为表达宿主构建重组菌并诱导表达,HPLC法检测重组酶催化4-AD脱氢的转化率;通过SWISS-MODEL同源建模分析KSDD结构,对预测的催化关键位点氨基酸残基进行定点突变并研究突变后重组酶的活性变化。结果:成功构建了表达脱氢酶KSDD的重组菌E.coli pET-22-ksdd,21℃下诱导表达后,重组酶对4-AD的转化率为27%;通过SWISS-MODEL同源建模预测出脱氢酶结构并对4个关键位点进行定点突变设计,获得突变子Y120R、Y320L、Y488F和G492Y。突变子Y120R和Y488F失活,证明其为酶的活性位点;突变子Y320L的转化率与野生型基本一致,但37℃反应条件下稳定性有所提高;突变子G492Y对4-AD的转化率是野生型的1.2倍,37℃条件下稳定性有所提高,是突变后氨基酸位点疏水性增加和周围静电作用改变所导致。结论:目前对简单节杆菌3-甾酮-△~1-脱氢酶结构分析及催化机理相关的研究较少,本研究验证了KSDD的活性位点,优化了酶的稳定性,为进一步对酶的性质进行定向改造打下了基础。