多壁碳纳米管固定化生物酶修饰电极检测杂色曲霉素的初步研究

色曲霉素（ST）是一种致癌致畸的真菌毒素,已报道的检测ST的技术有TLC、HPLC、ELISA以及毒素基因的PCR检测技术。初步探索了酶生物传感器三电极系统对ST的电化学分析。在实验中,应用多壁碳纳米管作为分子识别元件ADTZ的固定化基质和传感器的电子传递体构建了Au工作电极,对ST进行CV和DPV分析,结果表明：ST在-600mＶ位置有一明显的特征还原峰电位,线性检测范围是8.32×10^-5～6656×10^-5mg/mL,检测下限为8.32×10^-5mg/mL,响应时间10s,为进一步的研究打下良好的基础。     

T7启动子-11碱基突变对转录影响的研究

T7噬菌体启动子能被T7RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶Ⅱ系统启动转录 ,为研究两个系统转录的关键碱基 ,将合成的T7噬菌体启动子 1 1变异体与报道基因CAT基因连在一起。体内CAT和体外狭缝RNA杂交实验显示 : 1 1碱基是T7RNA聚合酶和真核生物RNA聚合酶Ⅱ系统启动T7启动子的关键碱基之一。     

用近场光学显微镜观察红细胞的自发荧光

传统的自体荧光检测技术均是对大量细胞或组织进行检测,而近场光学显微技术由于具有较高分辨率和能够同时获取样品的外部形貌和光学信息等特点,有望成为一种研究单个细胞自体发光机理、疾病诊断和检测单个细胞自体荧光光谱的新技术。本文通过应用近场光学显微镜观察不同形状红细胞的外部形貌和光学信息,来初步探讨近场光学显微技术在这方面的应用前景。     

三角褐指藻岩藻黄素-叶绿素蛋白复合体的分离纯化和功能研究

通过改进硅藻主要捕光天线(FCP)的分离和提取方法, 得到高纯度、高均一性的三角褐指藻FCP蛋白,并通过电泳、液相色谱、质谱和吸收荧光光谱学等手段研究三角褐指藻FCP的氨基酸序列、色素组成和捕光特点等, 初步预测三角褐指藻的结构和功能特点。结果表明三角褐指藻FCP含有198个氨基酸, 与高等植物LHCII的序列Identity约为24%。三维结构预测显示FCP具有与LHCII相似的三次跨膜螺旋框架结构, 但跨膜螺旋较短, 且无膜表面螺旋结构。FCP中主要结合了叶绿素a、叶绿素c、岩藻黄素, 不含叶绿素b, Chl. a/c为3.0。光谱学分析表明岩藻黄素可以在水下弱光环境中有效地捕获绿光, 并高效地传递至叶绿素。而岩藻黄素在400-500 nm区域吸收的光能, 向叶绿素传递效率较低, 预示着岩藻黄素在强光下也有一定的光保护功能。FCP中有4个叶绿素结合的保守氨基酸位点, 可能是其叶绿素结合位置, 但岩藻黄素的结合位置因其结构和结合位点的变化而无法预测。研究为进一步探索FCP的结构和功能特性奠定了基础。     

唇腭裂相关基因IRF6基因沉默促进细胞增殖和迁移并抑制上皮间质转化

干扰素调节因子6(interferon regulatory factor 6,IRF6)基因突变在单纯型和综合征型唇腭裂中均有报导。然而,其基因突变如何导致了唇腭裂的病理发生目前尚不清楚。本文以培养细胞为模型,研究了IRF6基因沉默对细胞增殖、迁移、凋亡以及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响,从而探讨唇腭裂形成的可能的分子病理机制。采用分子克隆技术构建IRF6真核过表达载体;设计合成IRF6基因特异siRNA,成功构建IRF6基因沉默和过表达细胞模型;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫印迹法(Western blot)检测转染siRNA-IRF6质粒48 h时,发现IRF6的mRNA和蛋白质表达均降低2倍;CCK8法检测转染siRNA-IRF6后,对细胞增殖能力提高1.98倍;划痕法观察转染siRNA-IRF6质粒72 h后检测细胞的迁移能力,比对照组增强2.36倍;利用Western印迹、qRT-PCR检测EMT标志性分子E-钙黏着蛋白(E-cadherin),发现过表达IRF6后EMT有显著降低。与对照相比,E-钙黏着蛋白表达下调3.57倍;流式细胞技术检测IRF6时未发现对细胞凋亡有影响。在体外培养细胞模型中,IRF6基因沉默显著促进了细胞的增殖和迁移,抑制EMT发生。提示IRF6这一唇腭裂相关基因有可能通过影响上述细胞事件,而导致唇腭裂的病理发生。     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A^*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒（HCMV）特异性细胞毒T细胞（CTL）免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A^*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A^*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A^*2402重链胞外域融合蛋白（HLA-A^*2402-BSP）的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E. coli)中有效表达HLA-A^*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端（N端）区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A^*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E. coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A^*2402限制性HCMV pp65_341-349抗原肽(QYDPVAALF, QYD)的可溶性HLA-A^*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24⁺供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8⁺T细胞的0.09％～0.37％。这些结果为进一步研究HLA-A^*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A^*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒（HCMV）特异性细胞毒T细胞（CTL）免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A^*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A^*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A^*2402重链胞外域融合蛋白（HLA-A^*2402-BSP）的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E. coli)中有效表达HLA-A^*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端（N端）区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A^*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E. coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A^*2402限制性HCMV pp65_341-349抗原肽(QYDPVAALF, QYD)的可溶性HLA-A^*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24⁺供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8⁺T细胞的0.09％～0.37％。这些结果为进一步研究HLA-A^*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

近场光学显微镜结合量子点标记人胃腺癌SGC-7901细胞靶点的观察

扫描近场光学显微镜突破衍射极限,具有纳米量级的空间分辨率,量子点(QD s)标记有荧光强度高且抗光漂白能力强等优点。结合上述两种技术,对人胃腺癌SGC-7901细胞膜表面特异性结合的叶酸受体(FR)进行成像探测,获得了叶酸受体在SGC-7901细胞膜表面上的分布,以及细胞内化外源性叶酸过程中叶酸受体在细胞膜表面的分布变化,成像的光学分辨率达到120 nm。实验结果表明:特异性结合的叶酸受体在SGC-7901细胞膜表面的分布,绝大部分是以聚集体的形式存在。随着SGC-7901细胞内化叶酸量的增加,叶酸受体在细胞膜表面的分布密度逐渐降低,并在经过120 m in左右趋于稳定。上述方法和手段为实现单细胞水平上靶点分布和变化的长期监测,肿瘤细胞内化受体的机制研究提供了新的技术途径。     

量子点的近场激发荧光特性研究

近场光学显微镜具有nm量级的空间分辨率,量子点(quantum dots,QDs)荧光探针具有激发谱宽、发射谱线窄、荧光强度高、抗光漂白和稳定性高等优点,两者结合用于生物大分子的成像探测和识别具有广泛的应用前景。用近场光学显微镜对链霉亲和素偶联的QDs进行近场荧光激发,并对其荧光发射特性和光稳定性进行研究,结果表明:近场光学显微镜nm量级的空间分辨率,可以同时观察到了QDs的单体、二聚体和三聚体;QDs的荧光发射强度高,近场荧光像对比度好,单量子点的荧光半高宽达到25nm;对一定入射波长的单色激发光,QDs的近场荧光强度随着激发功率密度的增加线性增加,并很快趋于稳定。与传统的荧光染料如异硫氰酸荧光素相比,QDs的稳定性非常好,在激发功率密度为300W/cm2的近场辐射下,量子点的荧光强度超过6h基本保持不变,其抗光漂白能力远远高于普通荧光染料。     

氨基磺酸应用于甘蔗渣预处理的研究

本研究尝试将氨基磺酸应用于甘蔗渣预处理,探究其作为酸预处理试剂对甘蔗渣成分和酶解的影响。氨基磺酸预处理最优条件为浓度3%,温度121℃,预处理1 h。在该条件下,甘蔗渣的固体回收率为64.45%,半纤维素和木质素去除率分别为70.81%和25.10%,纤维素损失率仅7.56%。与硫酸、盐酸预处理相比,氨基磺酸的半纤维素和木质素去除率不如硫酸、盐酸预处理,但固体回收率更高,纤维素损失率低,能保留更多纤维素有效成分。进一步酶解显示,氨基磺酸预处理的纤维素转化率高于硫酸、盐酸预处理。氨基磺酸作为一种新的酸预处理试剂,在木质纤维素降解上有良好应用前景。