基于CRISPR/Cas9的基因分析方法研究进展

自2012年首次证明了CRISPR/Cas9可以在体外进行DNA切割试验以来,CRISPR技术逐渐在基因编辑研究中获得了迅速的发展,除了应用于基因编辑领域之外,它在基因表达调控、基因成像、基因分析等方面也展现出了巨大的应用潜力。尤其在基因分析领域,CRISPR技术由于其精确的基因识别、室温的反应条件、易设计性和操作性等特色,使得一系列新型的基因检测技术得以发展,并取得了超越常规技术的一些检测参数。本文以Cas9蛋白为对象,综述了近些年来在该领域取得的研究进展。主要论述Cas9蛋白的功能、改造、引导RNA(sgRNA)的设计及其在基因分析方法上的应用。     

昆虫肠道微生物的研究进展和应用前景

昆虫肠道的独特结构和理化性质为多种多样的微生物定殖提供了特殊环境,肠道微生物的群落组成与宿主昆虫的生长发育、代谢繁殖等生命活动密切相关。种类丰富多样、生态位分布广泛的昆虫体内含有大量特化的肠道微生物群落,经过长期协同进化形成的共生关系具有多方面无可替代的优势。这种相对稳定的共生关系对昆虫整个生命周期具有极其重要的作用,肠道微生物不仅为宿主提供重要的营养物质、协助消化食物、提高宿主防御和解毒能力,还影响宿主昆虫的寿命、发育周期以及交配与繁殖能力等。同时,昆虫肠道微生物在农业、生态、医药以及能源环保等多个学科领域也显示出了巨大的应用前景。本文就昆虫肠道微生物群落的多样性、功能和影响肠道微生物生存因素,以及应用前景等方面进行综述,讨论了昆虫肠道微生物的最新研究进展。     

中国兽类分类与系统演化研究进展

中国兽类（即哺乳动物）种类繁多,对维持生态平衡发挥着重要的作用。自John R.Reeves于1829—1834年在我国广东开展兽类调查以来,近200年我国兽类分类及系统学研究取得了令世人瞩目的进步和发展。目前中国已知的兽类物种数已达686种,约占全世界兽类种数的10%,是世界上兽类物种多样性最丰富的国家之一。随着我国对生态环境保护的重视,生态环境日益改善,但全球气候变化、生境破碎化、人类活动增加及人兽共患重大疫情涌现等问题仍十分突出,兽类多样性调查及分类学研究的必要性越发明显。同时,兽类分类学这门古老而传统的学科也在不断引入各种新方法与技术,如整合分类学、标本数字化、模式标本测序、便携式测序技术及基于深度学习技术的物种识别鉴定等,分类学研究的成果及应用在近年得到了飞速发展。动物分类学作为传统的基础学科,是遗传学、生理学、生态学、医学、药学等现代生物学的基石。然而,由于学科特征和差异等原因,该学科近年来没有得到足够的重视,导致出现了学科萎缩和分类学人才后继无人的危机。因此,从国家层面对分类学、形态学等基础学科的人才培养、课题设置和资金投入等,予以特殊的政策支持,十分必要,也亟待解决。     

干旱对不同花椒种植模式下土壤微生物和线虫群落的影响

随着全球气候变暖, 我国岷江上游干旱区面积呈现增加的趋势。花椒(Zanthoxylum bungeanum)是岷江上游重要的经济树种之一, 对当地经济和社会发展起着重要作用, 提高花椒生态系统应对干旱干扰已成为迫切的问题。本研究设置了花椒单作、花椒-苜蓿(Medicago sativa)间作和花椒-大豆(Glycine max)间作3种种植模式, 在2015年8月对每种种植模式模拟干旱30 d, 每种种植模式包括干旱和对照处理, 在模拟干旱结束后、恢复15 d、30 d和45 d后分别采集土壤样品, 分析土壤化学性质、土壤微生物和线虫群落, 以探究花椒林下豆科植物能否缓和干旱的遗留效应对土壤化学性质和土壤生物的影响。重复测量方差分析表明: 在花椒单作模式下, 干旱恢复45 d后土壤硝态氮含量显著高于对照, 微生物量和真菌/细菌比与对照无显著差异, 线虫密度与对照无显著差异, 但线虫功能团没有恢复到对照水平; 在花椒-苜蓿间作模式下, 干旱恢复45 d后土壤含水量、铵态氮、硝态氮、溶解性有机碳、溶解性有机氮、微生物量、真菌/细菌比、线虫密度和线虫功能团组成与对照无显著差异, 但植食性线虫属Boleodorus相对多度显著高于对照; 在花椒-大豆间作模式下, 干旱恢复45 d后土壤含水量、铵态氮、硝态氮、溶解性有机碳、溶解性有机氮、微生物量和真菌/细菌比与对照无显著差异, 但线虫密度和功能团组成与对照有显著差异。在3种花椒种植模式中, 花椒-苜蓿间作模式下干旱的遗留效应对土壤养分和生物的影响最小。因此, 在干旱背景下, 花椒林下间作豆科植物可以加快土壤养分、土壤微生物和线虫群落的恢复, 进而有利于目标作物生长。     

稀土元素铈对花生幼苗生长与抗氧化保护酶系统的影响

采用溶液培养方法,研究不同浓度硝酸铈对花生(Arachis hypogaea)幼苗生长、开花数目及抗氧化酶过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性与丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明,与对照相比,铈浓度低于20.0 mg·L–1能促进花生幼苗生长及开花,其中以10.0 mg·L–1铈的效果最为明显,其生物量和开花数分别约为对照的1.3倍和2.8倍;但高于20.0 mg·L–1则抑制花生幼苗生长,降低花朵数目;同时,低于20.0 mg/L铈可抑制花生幼苗过氧化物酶(POD)活性和降低其丙二醛(MDA)含量,其中以10.0 mg·L–1铈的抑制效果最明显,其POD活性和MDA含量约为对照的47.51%和20.76%;而低于20.0 mg·L–1铈能提高花生幼苗的超氧化物歧化酶(SOD)活性,其中以5.0 mg·L–1铈的促进效果最明显,其SOD活性约为对照的2.0倍。     

成年雄性斑胸草雀前脑与中脑对习得性发声控制的侧别差异

成年雄性鸣禽的习得性发声信号——长鸣(long call)和鸣唱(song)是由前脑高级发声中枢启动,以及由前脑最后一级输出核团弓状皮质栎核(robust nucleus of the arcopallium,RA)整合输出.RA投射神经元与位于中脑的基本发声中枢丘间复合体背内侧核(dorsomedial nucleus of the intercollicular,DM)形成突触连接.该文采用电损毁与声谱分析相结合的方法,通过依次损毁成年雄性斑胸草雀(Taeniopygia guttata)单侧RA和DM核团,探讨了前脑和中脑对习得性发声的影响.结果提示,RA核团与DM核团共同参与了对雄性斑胸草雀习得性声音的调控,而且这种控制具有右侧优势.     

全氟辛烷磺酰基化合物对剑尾鱼肝脏抗氧化物酶活性的影响

目的研究全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)暴露对剑尾鱼(Xiphophorus helleri Heckel)抗氧化物酶活性的影响,探讨PFOS对鱼类的致毒机理。方法使用浸润法以3.5、7.0、14.0和28.0 mg/L四个PFOS浓度为剑尾鱼染毒,定量测定了96 h内肝脏组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性及丙二醛(MDA)含量的变化。结果 PFOS暴露12 h后,除28.0 mg/L组SOD活性被显著性抑制外,其余各组与对照组均无显著性差异(P>0.05);7.0 mg/L组和14.0 mg/L组在24 h被极显著诱导(P<0.01),并且一直保持至96 h。CAT活性随PFOS浓度的升高而降低,12 h时,除3.5 mg/L组外,其余各组CAT活性被显著或极显著抑制,至24 h时,各组CAT活性有上升趋势,但48 h后,各组呈不断下降趋势持续至96 h,其CAT活性恢复到12 h水平。GSH-PX活性变化与CAT活性变化趋势相似,其中28.0 mg/L组在不同时间均被显著性抑制,并在96 h时抑制率达到最高值64.8%。MDA含量在12 h时呈小幅下降趋势,但随着暴露时间的延长,各处理组MDA含量呈连续上升趋势,并在96 h时达到最高点,诱导率分别为71.2%、70.1%和85.1%。结论结果表明,SOD的高活性是由于机体中超氧阴离子的存在,而高浓度的超氧阴离子能够灭活CAT和GSH-PX活性,因此,CAT和GSH-PX活性始终低于对照组。GSH-PX对PFOS的敏感性高于CAT。MDA含量持续升高反映出细胞组织已经遭受到氧化损伤。剑尾鱼活体的实验表明,PFOS能够诱导肝脏氧化应激反应,氧化损伤是PFOS致毒的主要途径之一。     

de novo转录组学分析华南地区入侵植物五爪金龙代谢特征

为探究华南地区严重入侵植物五爪金龙(Ipomoea cairica)生物入侵的分子机制,对五爪金龙及其近缘种七爪金龙(I. digitata)和裂叶牵牛(I. nil)进行de novo转录组测序和组装,得到56551条unigenes,其中56522条得到注释,7815条GO注释,15615条COG注释,180201条KEGG数据库注释。转录组分析结果表明,五爪金龙氮代谢通路关键酶基因的表达高于对照。次生代谢关键酶(PAL、4CL、CAD、查耳酮合酶、苯基丙乙烯酮异构酶、槲皮黄3-O-甲基转移酶等)基因在五爪金龙与七爪金龙及裂叶牵牛中均得到协同性的差异表达,而这些代谢通路指导的产物合成对五爪金龙的抗逆境能力、生长、化感作用等均起关键作用。关键基因的RT-qPCR验证结果与转录组结果具有一致性。因此,这从分子生物学层面上对解释五爪金龙在华南地区的入侵机制提供了新的证据。     

hnRNPA1基因在家蚕翅原基组织中的表达与定位分析

核不均一蛋白A1(hnRNPA1)是一个重要的RNA结合蛋白。本研究旨在获得家蚕hnRNPA1基因的cDNA,并对其在家蚕翅原基组织进行表达和定位分析。以家蚕幼虫期翅原基mRNA为模板通过反转录克隆家蚕BmhnRNPA1基因的全长cDNA,并对其进行生物信息学分析。构建pET32a-BmhnRNPA1蛋白表达载体,表达且纯化得到BmhnRNPA1重组蛋白,并制备该蛋白多克隆抗体,通过实时荧光定量RT-PCR、Western blot和免疫组化方法检测BmhnRNPA1在家蚕幼虫和蛹翅原基组织中的表达与定位。克隆得到了家蚕hnRNPA1基因的全长cDNA片段,其开放阅读框(ORF)序列为951 bp,编码316个氨基酸,预测分子量为34.98 kDa,等电点为5.15。编码蛋白在第18～90个氨基酸和109～181个氨基酸处为保守的RRM结构域。系统进化分析显示,家蚕hnRNPA1与小菜蛾hnRNPA1的亲缘关系最近。QRT-PCR结果显示,BmhnRNPA1在家蚕幼虫和蛹期的翅原基组织中均有表达,且在蛹期第3天的表达量达到峰值。Western blot进一步证实了实验结果。免疫组化分析结果显示,该蛋白存在于翅原基组织中,并定位于细胞核内。家蚕BmhRNPA1具有两个RNA结合结构域,属于hnRNPs家族,定位于细胞核内,表明其可能参与mRNA的选择性剪接作用。本研究结果为进一步探索该基因的功能提供了基础。     

家蚕BmChd64基因的克隆与表达定位分析

Chd64是含有钙结合蛋白同源（Calponin homology,CH）结构域的蛋白,在果蝇蜕皮激素与保幼激素信号通路中发挥重要作用。本研究以家蚕Bombyx mori为研究对象,利用PCR克隆了与果蝇Drosophila melanogaster DmChd64同源的BmChd64基因,与表达载体pET-28a连接后,成功获得体外原核表达的BmChd64蛋白,并对其进行了亚细胞定位分析。家蚕BmChd64基因开放阅读框（ORF）的序列为567 bp,编码188个氨基酸,预测分子量大小为20.9 kDa,理论等电点为8.41,编码的蛋白在第27~130个氨基酸处存在CH结构域。同源性比对与进化分析显示,BmChd64与赤拟谷盗Tribolium castaneum和果蝇的Chd亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示,BmChd64在家蚕5龄游走期的不同组织中均有表达,且在翅原基中的表达趋势与家蚕体内蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）滴度变化规律一致。亚细胞定位结果显示,BmChd64在细胞核与细胞质中均有分布,细胞核内荧光信号较强,且在细胞核外围较弱,推测细胞质中BmChd64也可入核,最终定位在细胞核中。研究结果表明BmChd64可能主要通过20E信号通路调控翅原基等的变态发育,这为进一步完善20E调控昆虫变态发育的分子机制提供了实验基础。