酿酒酵母合成木栓酮及其衍生物的研究现状及展望

木栓酮及其衍生物在植物中普遍存在且种类繁多,具有丰富的生理药理学活性。木栓酮衍生物是以木栓酮为骨架经细胞色素氧化酶P450(cytochromeP450,CYP450)及UDP葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferase, UGT)修饰而来。植物中天然木栓酮及其衍生物的含量极低,传统的萃取分离和化学合成效率低、能耗高且污染环境,因此,利用酿酒酵母作为宿主菌生产木栓酮及其衍生物是一种高效且环保的策略。本文从增加前体含量、提高酶活性和产物合成的亚细胞定位等方面介绍并展望了木栓酮在酿酒酵母中高效生产的策略,并介绍了目前几种常见的木栓酮衍生物研究现状,从根据碳骨架相似性挖掘CYP450、蛋白质工程改造CYP450和合成代谢基因簇的挖掘等方面展望了木栓酮衍生物的合成途径解析的新思路。     

基于诱导性多潜能干细胞的亨廷顿舞蹈病发病机制研究

目的:基于诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSC)多潜能性的特点将亨廷顿舞蹈病(Huntington disease,HD)患者和正常人特异性i PSC定向诱导分化成运动神经元,并在运动神经元的基础上探讨HD的发病机制。方法:将HD患者和正常人的i PS细胞在特定的生长因子和神经因子的作用下定向诱导分化成运动神经元。然后用免疫荧光染色检测运动神经元特异性标记物HB9和ISL1的表达。以DCFH-DA和JC-1为荧光探针,利用流式分析法分别对正常人和HD患者运动神经元细胞活性氧和线粒体膜电位进行检测。结果:经过25天诱导分化成功得到HD患者和正常人的运动神经元,并且免疫荧光染色显示,βIII-微管蛋白阳性的神经细胞同时表达运动神经元特异性的标志物HB9和ISL1。此外,经实验统计发现HD患者运动神经元细胞内代表活性氧水平的荧光强度(4704.33±390.50)较正常组(2840.33±166.20)有明显增强(P=0.002),而且代表线粒体膜电位红绿荧光强度比(2.74±0.13)较正常组(3.97±0.29)相比有明显降低(P=0.03)。结论:HD患者特异性i PSC能够诱导分化成运动神经元,为实验提供研究模型。HD的发病与运动神经元细胞线粒体功能障碍有关。     

中国11个双子叶植物原白中排印错误之更正

对我国11个双子叶植物（Dicotyledon）原白中模式标本引证的排印错误做了更正：砚山锥栗（壳斗科）原白中错误地将模式标本引证为王启无84116,实际应为王启无84416,前者属于菊科植物Inuna helianthus-aquatica C.Y.Wu ex Ling。长果柯（壳斗科）原白中错误地将模式标本引证为K.M.Feng 13012,实际应为K.M.Feng 13102,前者属于冬青科植物Ilex triflora Bl.。福建红小麻（荨麻科）原白中错误地将主模式标本引证为C.J.Chen&Z.Y.Li 109,实际应为C.J.Chen&Z.Y.Li 103,前者属于荨麻科植物Oreocnide frutescens（Thunb.）Miq.。少毛全缘叶紫麻（荨麻科）原白中错误地将主模式标本引证为N.K.Chun 44099,实际应为N.K.Chun 44033,前者属于杜鹃花科植物Lyonia ovalifolia（Wallich）Drude var.rubrovenia（Merr.）Judd.。甘南铁线莲（毛茛科）原白中错误地将主模式标本引证为Baishuijiang Exped.4490,实际应为Baishuijiang Exped.4990,前者属于卫矛科植物Euonymus alatus（Thunb.）Sieb.。矮粗距翠雀花（毛茛科）原白中错误地将模式标本引证为Sichuan Veg.Exped.3137,实际应为Sichuan Veg.Exped.3173,前者属于龙胆科植物Gentiana conduplicata T.N.Ho。镇康黄芪（豆科）原白中错误地将主模式标本引证为T.T.Yu 17255,实际应为T.T.Yu 17225,前者属于莎草科植物Scirpus lushanensis Ohwi。宽翼棘豆（豆科）原白中错误地将模式标本引证为Qinghai-Xizang Comp.Exped.9484,实际应为Qinghai-Xizang Comp.Exped.9485,前者属于石竹科植物Arenaria kansuensis Maxim.。肾瓣黄芪（豆科）原白中错误地将模式标本引证为Qinghai-Xizang Comp.Exped.3650,实际应为Qinghai-Xizang Comp.Exped.3605,前者属于麻黄科植物Ephedra gerardiana Wall.ex Mey.。湖南长柄槭（槭树科）原白中错误地将模式标本引证为李泽棠2944,实际应为李泽棠2994,前者属于杜鹃花科植物Pieris formosa D.Don。峨眉勾儿茶（鼠李科）原白中错误地将模式标本引证为杨光辉54729,实际应为杨光辉54723,前者属于山茱萸科植物Helwingia chinensis Batalin.。     

AC3-33基因沉默对乳腺癌细胞体外迁移能力的抑制作用

乳腺癌是女性高发恶性肿瘤之一,其发生发展是一个多基因参与的复杂过程。AC3-33是一个可以抑制AP-1活性的分泌蛋白,本研究旨在探讨AC3-33在乳腺癌细胞中的表达及其调控乳腺癌迁移的功能。首先采用定量-PCR检测了AC3-33在ZR-75-30、MDA-MB-231、T-47D和MCF-7 4种乳腺癌细胞中的表达差异;然后构建了3个特异性沉默AC3-33表达的载体,采用双荧光素酶实验、定量-PCR和绿色荧光观察筛选沉默效果最明显的质粒用于后续实验;最后采用Transwell迁移实验检测了过表达或沉默内源性AC3-33对MCF-7细胞迁移的影响。研究表明AC3-33在4种乳腺癌细胞中均高表达;通过双荧光素酶实验、定量-PCR和绿色荧光强度的检测确定si-AC3-33沉默AC3-33表达的效果最佳;迁移实验表明过表达AC3-33可以抑制MCF-7细胞的迁移能力,而特异性沉默内源性AC3-33的表达,MCF-7细胞的迁移能力则会显著增强。本研究证明了AC3-33具有抑制乳腺癌细胞迁移的作用,希望为乳腺癌的防治提供新的防治靶点。     

高质量抗体揭示Rad1蛋白在细胞中新的潜在活动机理

一组在进化上(从酵母到人)保守的基因Rad9、Rad1和Hus1在细胞周期监控点调控和DNA损伤修复中发挥重要作用．这三个蛋白可以形成环形异源三聚体,即9-1-1蛋白复合体．9-1-1复合体被认为是Rad9、Rad1和Hus1行使功能的主要形式．到目前为止,没有一个好的抗Rad1的抗体,严重阻碍了对Rad1和9-1-1复合体的研究．在本研究中,我们成功地制备了一株小鼠抗Rad1蛋白的单克隆抗体．这个抗体能够有效地检测小鼠和人的内源Rad1蛋白,可以用于酶联免疫吸附、蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀和免疫荧光等实验．利用该抗体,我们发现在DNA损伤剂羟基脲(HU)的诱导下,小鼠Rad1蛋白在Rad9^+/+小鼠胚胎干细胞中表达明显增加,而在Rad9^-/-的小鼠胚胎干细胞中没有观察到该现象,这表明Rad9对Rad1的蛋白表达有调控作用．此外,内源的Rad1蛋白主要分布在细胞质中,在HU处理后并没有迁移进入细胞核的现象,这与先前广泛被人们所接受的在DNA损伤压力下Rad1和Hus1能够迁移进入细胞核并与Rad9形成9-1-1蛋白复合体的说法相矛盾．综合看来,Rad1和9-1-1蛋白复合体的分子作用机制比预期的要复杂,我们成功制备的Rad1单克隆抗体将成为研究Rad1以及9-1-1蛋白复合体的强有力的工具．     

拟南芥CBL9的质膜定位对花粉管顶端生长的影响

旨在揭示拟南芥CBL9(Calcineurin B-like protein 9)在花粉管顶端生长中的作用。基于花粉管瞬时表达体系,通过基因枪技术将带有黄色荧光蛋白(YFP)标签的CBL9在烟草花粉中进行瞬时表达,观察其亚细胞定位及过表达表型。针对CBL9的N端酰基化的保守位点,通过点突变技术构建CBL9G2A突变体,对比研究其表型及定位的改变情况。结果显示CBL9-YFP定位于花粉管顶端质膜及颗粒状细胞器上,CBL9过量表达可以引起显著的花粉管去极化生长。而CBL9G2A-YFP则表现出非特异性的胞内弥散定位,同时CBL9G2A过量表达没有显著影响花粉管的顶端生长。CBL9的N端酰基化位点是CBL9质膜定位的重要因素,而正确定位的CBL9才能发挥调控花粉管生长的相关功能。     

持续激活型CIPK9在花粉管生长过程中的生物学功能及亚细胞定位分析

植物的花粉管生长是一个多因素参与的生理学过程,需要多种信号传导系统来引导植物细胞完成。钙离子作为第二信使,可以通过钙传感器CBLs激活下游的蛋白激酶CIPKs参与调控细胞的极性发育过程。该研究中 CIPK9 被确定为候选基因,其C端与绿色荧光蛋白(GFP)相融合,通过基因枪技术在烟草花粉中进行瞬时表达,观察对应的亚细胞定位及花粉管中诱导的表型。结果表明:(1)GFP标记的CIPK9定位于花粉管中高速运动的颗粒状细胞器,并可随胞质环流进行规律的运动,为进一步探究CIPK9的生物学功能,还构建了持续激活型CIPK9(CACIPK9)。(2)与全长CIPK9相比较,CACIPK9缺少C末端的调控区域,并在激酶区域的激活环中进行了点突变,从而表现出不受调控的持续高活性。(3)缺少C端调控区的CACIPK9表现出非特异性的亚细胞定位,即与GFP对照相同的胞内弥散定位,说明CIPK9的C末端调控区对于其在花粉管中的正确定位发挥重要的调控作用。另外,CACIPK9过表达可以引起花粉管的去极化生长表型。这表明CIPK9作为钙信号下游家族的一员参与了花粉管极性生长的相关过程,并对花粉管的生长具有一定的调控作用。     

C2株贾第虫醛糖还原酶的原核表达与生物信息学分析北大核心

[目的]克隆、原核表达、纯化C2株蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,简称贾第虫)醛糖还原酶(Aldose reductase,AR)基因,并进行生物信息学分析。[方法]从C2株贾第虫基因组DNA中克隆贾第虫AR编码区,双酶切连入原核表达载体pET-28a(+),酶切和测序进行验证,并进行生物信息学分析;将构建成功的重组质粒pET-28a(+)-AR转化大肠杆菌Rosetta(DE3)并进行诱导表达,SDS-PAGE及Western Blot验证表达效果;镍亲和层析纯化AR蛋白,SDS-PAGE观察纯化效果。[结果]成功克隆了C2株贾第虫AR蛋白编码区并构建了原核表达载体,SDS-PAGE及Western Blot显示,AR表达载体转化的大肠杆菌经诱导可表达出相对分子量约37.2k Da的目的蛋白,与预期一致;重组蛋白通过亲和层析获得了高效纯化;生物信息学分析显示贾第虫AR蛋白主要二级结构为无规则卷曲,整体为一个NADPH依赖的氧化还原酶结构域。AR蛋白在真核生物中相当保守,贾第虫AR蛋白在进化上相对独立。[结论]证实了贾第虫AR蛋白的存在并明确了其结构和进化上的特征,为贾第虫AR抗体的制备和功能的研究提供了基础。     

反选标记法在微生物基因敲除中的应用

随着后基因组时代的到来,简单高效的基因编辑工具和方法在研究微生物的基因表达调控、工程菌株的遗传改造等方面发挥了巨大作用。反选标记法是基于同源重组原理进行基因敲除的一种便捷高效的方法,该方法通过选择性的遗传标记的丢失和回补,实现对靶基因的敲除或目的基因的插入等分子遗传操作。这种选择性的遗传标记一般不依赖于传统的抗生素筛选标签,且同一反选标记能够反复使用,可连续进行多轮遗传操作,实现对多个基因靶位点的分子编辑。对近年来反选标记基因的种类、作用原理及在微生物基因敲除实验中的应用进行综述,以期为高效、可靠的分子编辑方法的研究提供参考。