转双抗虫基因烟草的研究

用改造的雪花莲凝集素基因GNAmm与合成的苏云金芽孢杆菌(Bt)毒蛋白cry1Ac基因构建了带有双价基因的植物表达载体,在该表达载体中这两个基因的转录分别受笋瓜PP2启动子(SPP2P)和CaMV 35S启动子的调控。通过根癌土壤杆菌介导转化法,获得了一批抗卡那霉素的转化再生烟草植株。PCR检测及基因组DNA Southern blot\,Slot blot杂交分析的结果表明Gna基因和Bt基因已整合到烟草总DNA中。用Bt毒蛋白抗血清进行Western blot分析,转基因植株均有Bt杀虫蛋白的不同程度的表达。对转化再生烟草的虫试结果表明,在所受试的19株烟草中60%的植株上的棉铃虫在5天内死亡率达到100%,而且存活幼虫的生长发育受到明显抑制;蚜虫抑制生长试验表明,多数转化再生植株具有较强的抗蚜活性,平均能够抑制桃蚜50%～60%的蚜口密度,有的高达80%以上。以上结果表明利用这两个改造过的抗虫基因可以获得既抗虫又耐蚜的转双抗虫转基因植物。     

转基因植物中Bt杀虫蛋白的重组噬菌体辅助检测

以LRP和棉花总蛋白为本底蛋白,纯化的Bt杀虫蛋白为目标蛋白,利用噬菌体展示技术从噬菌体的随机七肽库中筛选与Bt蛋白特异性结合的七肽.ELISA检测表明经过三轮淘筛过程,特异性多肽得到了高度富集,其中PH5可与Bt蛋白特异性结合.将筛选出的PH5作为Bt蛋白的“类抗体”用于抗虫转基因植物的检测,由此建立了一种新的检测方法,讨论了噬菌体展示技术在植物基因工程中的潜在应用价值.     

抗虫转基因欧洲黑杨的培育

用带有３５Ｓ－Ω－Ｂｔ－ＮＯＳ嵌合基历的双元载体的农杆菌ＬＢＡ４４０４转化欧洲黑杨的叶片外植体,共独行５４株转化再生植株,用这些再生植物对杨尺蠖进行毒力测定,昆虫校正死亡率在８０－９６％的再生植株占总测定植株的１５％。部分再生植株对舞毒娥进行测定,表明在５－９天内校正死亡率高达１００％,存活昆虫的生长和发育也明显地受到抑制。根据苗木在苗圃中高生长的昆虫校正死亡率采用重心聚类法进行分析。初步选出高生     

T-DNA标签在转基因水稻基因组中的整合特点

利用热不对称交错PCR (TAIL-PCR),对200个含T-DNA插入的转基因水稻株系进行分析,获得了159个T-DNA右边界侧翼序列. 其中,92个序列含有T-DNA右边界和侧邻的水稻基因组序列,78个序列与已公布的水稻BAC/PAC克隆有97%～100%的同源性,从而可作为T-DNA标签定位在水稻的12条染色体上. 结合先前定位的169个T-DNA标签,对T-DNA在水稻基因组中的整合特点进行了分析. 结果发现,在T-DNA右边界和侧邻的水稻基因组序列的连接处,14.6%的T-DNA标签含有3～74bp的填充序列. 在不含填充序列的连接处,21.3%的T-DNA标签,在整合后的T-DNA右边界与侧翼的水稻基因组序列之间显示出3～5 bp的微同源性. 填充序列和微同源性的存在,揭示了T-DNA在水稻基因组中的整合既存在双链断裂修补机制,又存在单链裂缝修补机制. T-DNA倾向于整合到富含A/T核苷酸的基因组区域,即主要在基因的5′和3′端调控区以及内含子中.     

新基因水稻OsLSD1的克隆及拟南芥和水稻类 LSD1基因家族的生物信息学分析

类LSD1 (LSD1-like)基因家族是一类特殊的C2C2型锌指蛋白基因,编码植物特有的转录因子.目前已经研究的2个成员拟南芥LSD1(1esions stimulating disease resistance 1)和LOL1(LSD-One-Like 1)基因均参与植物细胞程序化死亡(programmed cell death,PCD)的调控.从水稻cDNA文库中克隆到1个类LSD1基因,命名为OsLSD1.该基因长988 bp,包含一个432bp的开放阅读框,推导的氨基酸序列(143个氨基酸)含有3个内部保守的锌指结构域.DNA印迹结果表明OsLSD1基因在水稻基因组中为单拷贝,且在根、茎和叶中表达.借助于生物信息学分析技术,从拟南芥和水稻数据库中各识别出5个和7个(包括OsLSD1)类LSD1基因.分析了这些类LSD1基因的结构,蛋白质结构域组成.系统进化分析表明,无论基于编码区的核苷酸或氨基酸序列都可以将这些类LSD1基因分为2类.虽然不存在拟南芥或水稻特有的类LSD1蛋白,但有些结构域是水稻所特有的,也有些基因是来源于复制事件.     

ACA基因启动子的克隆及功能初探

根据已知的ACA基因的 5 '端序列设计三个基因特异的反向引物 (GSP-1,GSP-2 ,GSP-3)分别与 11个简并引物 (AD1-AD11)配对 ,进行热不对称嵌套PCR(ThermalasymmetricinterlacedPCR ,TAIL-PCR)扩增 ,获得了ACA基因起始密码子上游约700bp的片段。为检测其表达特性 ,构建了该片段与Gus嵌合基因的表达载体pBpAG ,在真空条件下通过农杆菌介导 ,转化了植物的叶、果实、种子三种不同组织 ,Gus瞬时表达染色结果显示 ,该DNA片段具有种子特异的启动子活性。对该启动子的一些顺式元件进行了讨论。     

绿色荧光蛋白基因(GFP)在抗虫转基因植物研究中的应用(英文)

用合成的cry1Ac基因与绿色荧光蛋白基因 (GFP)构成融合蛋白基因 ,然后和改造的GNA基因构建双价抗虫基因植物表达载体pBGbfg ,经根癌农杆菌介导转化了烟草。在紫外灯照射下 ,观察到转基因植株叶片中有较强的绿色荧光 ;经抗虫试验、PCR、Southernblot和Westernblot等检测 ,表明该重组植物表达载体能够在转基因植物中有效表达外源基因 ,转基因植株绿色荧光的表型与其抗虫性密切相关。从而成功地建立了以绿色荧光蛋白基因与抗虫基因组成的融合基因转化系统 ,简化了抗虫转基因植物筛选程序 ,有助于快速获得双价抗虫转基因植株。     

几丁质酶-葡聚糖酶双价基因导入滇型杂交稻恢复系提高稻瘟病抗性的研究

将含有菜豆(Phaseolus limensis)几丁质酶基因和烟草(Nicotiana tabacum)β-1,3-葡聚糖酶基因的pBLGC(16.5 kb)质粒用基因枪法导入滇型杂交稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)恢复系"南29"中,总计获得93个转化再生植株,以β-1,3-葡聚糖酶基因制备探针对T1代株系进行Southern杂交分析,17个株系为杂交阳性,证实外源基因完整结构已整合到水稻基因组中;连续多代的PCR追踪检测证实外源基因已遗传至T4代;对所获得的6个PCR检测阳性T4代品系进行了稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)生理小种接种鉴定和稻瘟病大田诱发鉴定,结果表明,转基因品系对稻瘟病的抗性较受体对照大幅度提高,获得了稻瘟病新抗源,但不同品系稻瘟病抗性并不相同.     

转新型双抗虫基因棉花的遗传分析

首次用含合成的BtCrylAc活性杀虫蛋白嵌合基因及慈菇蛋白酶抑制剂B(API-B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体,通过土壤根癌杆菌介导转化棉花品种冀合321,获得一批抗虫的转化再生棉花植株。利用叶片涂抹卡那霉素、叶片离体养虫和PCR扩增等检测方法对6个不同转双抗虫基因株系的抗虫性进行遗传分析。结果显示,转化株系自交的T1抗虫性状遗传较为复杂;农杆菌介导获得的转基因抗虫棉在早期世代不易选到纯合系,但是随着对抗虫性状进行单向选择,到T4和T5就能获得抗虫纯合系。利用抗虫性稳定的转化后代材料和转化受体进行田间杂交,发现F2抗虫性分离完全符合一对或两对显性基因的分离规律,并证明了DR248和DR193两个材料为外源基因双拷贝插入。转化株系的Southern杂交也证明了上述结果。     

植物多肽抗生素研究进展

植物多肽抗生素是一类对细菌、真菌等微生物及某些昆虫和动植物细胞具有抑制或杀灭作用的小分子多肽. 根据多肽抗生素的氨基酸序列及二级结构,可将植物多肽抗生素分为9类,包括硫素（thionins）、植物防御素（plant defensins）、转脂蛋白（lipid transfer proteins, LTPs）、橡胶素（heveins）、打结素（knottins）、凤仙花素(1b-AMPs)和新近发现的荠菜素（shepherdins）、蜕皮素（snakins）、环肽（cyclotides）. 对近年来植物多肽抗生素的分类、抗菌机理、生物活性及基因工程等方面的研究情况作一介绍,希望有助于我国在这一领域的研究与开发.