白假丝酵母Vps74蛋白的鉴定及其功能

【背景】Vps74/GOLPH3是参与高尔基体蛋白糖基化修饰的关键蛋白,并且是重要的磷酸磷脂酰肌醇效应因子,在胞内参与多种信号通路。【目的】鉴定白假丝酵母Vps74蛋白,并探索其在该病原菌压力应答、蛋白分泌、形态发生及致病过程中的功能。【方法】采用在线序列比对方法,初步鉴定白假丝酵母Vps74蛋白;采用两步PCR介导的同源重组方法,构建白假丝酵母vps74基因缺失菌株vps74Δ/Δ及回补菌株VPS74c;采用反向遗传学方法,探究Vps74在白假丝酵母的压力应答、蛋白分泌、形态发生及致病过程中的功能。【结果】白假丝酵母中存在典型的Vps74/GOLPH3同源蛋白,Vps74参与蛋白糖基化修饰过程,vps74基因缺失导致白假丝酵母蛋白分泌能力、形态发生能力、黏附能力以及侵染宿主能力的显著降低。【结论】Vps74通过影响蛋白分泌、形态发生、黏附、嵌入式生长等过程,在白假丝酵母致病过程中发挥重要作用。     

白假丝酵母CFL1基因通过转录调控参与氧化压力应答

【背景】CFL1基因是白假丝酵母高铁还原酶基因,介导胞外铁离子的还原,在白假丝酵母胞内铁稳态的维持方面发挥着重要作用。【目的】研究CFL1基因调节氧化压力应答的分子机制。【方法】采用液体培养及巨噬细胞模型,测定CFL1缺失对氧化压力耐受性和杀伤巨噬细胞能力的影响;使用羟基自由基清除剂二甲基亚砜(DMSO)分析其对缓解氧化压力敏感性的影响;采用实时荧光定量PCR分析CFL1缺失对氧化压力应答基因表达的影响;采用过氧化氢酶(CAT)活性测定方法研究CFL1缺失对CAT1基因表达的影响;通过构建WT-CAT1-GFP和cfl1Δ/Δ-CAT1-GFP菌株分析过氧化氢酶基因过表达对cfl1Δ/Δ氧化压力敏感性的影响。【结果】白假丝酵母CFL1基因的缺失会造成杀伤巨噬细胞能力的减弱,氧化压力应答基因表达的下降。过氧化氢酶基因的过表达则能恢复与野生型几乎一致的氧化压力水平。【结论】CFL1基因通过转录调控参与白假丝酵母氧化压力应答过程。     

减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因

用长距离RT-PCR扩增了传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus, IBDV）ZJ2000株多聚蛋白基因,定向克隆入真核表达载体Pci,电转化dam^-和phoP^－双突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株,并直接转染Vero细胞。RT-PCR和间接免疫荧光试验可从Vero细胞中检测到阳性信号,SDS-PAGE和West blotting均可检测到41kD的蛋白条带。结果表明减毒沙门氏菌可将外源基因导入Vero细胞,并进行转录和表达,具有免疫反应性,为进一步研制减毒沙门氏菌为载体的IBDV口服DNA疫苗打下基础。     

基于边际回归的沈阳市绿化树种人工油松冠形模拟

构建城市典型绿化树种树冠外部轮廓预估模型,可以为城市绿化树种的空间配置优化奠定基础。本研究以辽宁省沈阳市典型绿化树种人工油松为对象,基于Crown Window装置获取60株样木树冠形状,利用幂函数、分段抛物线方程和修正Kozak方程选取基础模型,通过再参数化引入树冠结构因子(最大树冠半径)和相邻木竞争变量(相邻木平均树高、平均胸径、平均冠幅、相邻木株数,以及样木与其相邻木平均树冠接触高),构建耦合相邻木竞争及树冠结构因子的油松树冠外部轮廓预估模型。结果表明: 修正Kozak方程R_a²最大、均方根误差(RMSE)最小,模型稳定性良好,选取其为构建油松冠形模型的基础模型。通过再参数化在基础模型中引入最大树冠半径和相邻木平均胸径后,模型的R_a²提高0.0693,MSER为14.4%。分析最大树冠半径和相邻木竞争对油松树冠形状的影响发现,最大树冠半径对树冠形状影响较大,树冠半径随最大树冠半径增大而增大;相邻木平均胸径对树冠形状影响相比最大树冠半径较弱,树冠上半部分随相邻木竞争增强而增大,树冠下半部分随相邻木竞争增强而变小。本研究构建的耦合相邻木竞争及最大树冠半径的油松树冠外部轮廓边际回归模型具有良好的拟合优度,能够合理地模拟及预测沈阳市典型绿化树种人工油松的树冠形状。     

柑桔叶片害虫群落结构的生态位研究

分析了柑桔叶片害虫群落在水平、垂直和时间序列上的生态位。表明：叶片害虫群落在水平分布上是均匀的;在树冠层次上,中上层较中下层稳定且均匀;在时间节律上,全年均有分布的只有白轮蚧,分布最窄的为刺蛾类。经模糊聚类分析表明,柑桔叶片害虫群落由3个集群和3个边缘种组成。     

我国地方品种萧山鸡白介素2基因的克隆和分子进化分析

鸡白介素细胞2（cIL-2）是新近确定的非哺乳动物类细胞因子。建立了体外诱导鸡IL－2的最佳条件,从ConA激活的脾脏T淋巴细胞中克隆了我国地方品种鸡（浙江萧山鸡）IL－2 cDNA。该基因全长737bp,编码143个氨基酸的前体蛋白质。其编码序列与已公布的3条鸡IL－2仅有1－5个氨基酸的差异,与火鸡的IL－2同源性高达69.4%,与其他哺乳动物IL－2的同源性在21.2%－29.4%之间。二级结构预测表明,N端存在一长22个氨基酸的前导肽,4个关胱氨酸形成两个链内二硫键,并存在类似人IL－2的4个α螺旋,这些结构在维持IL－2生物学活性中起到重要作用。另外D^40、Y^65、E^82、N^108和Q^142等 在酸可能参与鸡IL－2受体的结合。分子系统进货树分析表明,鸡IL－2和哺乳动物IL－2有着共同的祖先;在免疫系统选择性压力下,形成独特的种族特异性。     

传染性法氏囊病病毒感染性克隆的快速构建

用长距离RT PCR一步扩增并克隆全长为 2 82 7bp的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)的B节段基因组cDNA ,通过定点的沉默突变在B节段编码区引入一个EcoRV酶切位点作为分子标记。分别构建IBDV的A、B节段基因组真核表达载体 ,在脂质体介导下共转染Vero细胞。RNA点杂交、间接免疫荧光分析表明重组子在Vero细胞得到了表达 ;用转染细胞的培养上清液不断地接种新的Vero细胞 ,模拟病毒“传代” ,观察到细胞形态学发生变化 ,产生了类似野生IBDV感染细胞时出现的细胞病变效应 (CPE) ;电子显微镜下可以看到符合IBDV病毒粒子结构的物质 ;酶切鉴定验证了所引入的分子标记 ,证实人工IBDV获得拯救。建立的基于长距离RT PCR和RNA聚合酶Ⅱ系统的快速、简易的IBDV感染性克隆构建方案 ,为开发新一代抗IBDV的基因缺失疫苗创造了条件。