利用CRISPR/Cas9技术建立OXTR基因敲除猪胎儿成纤维细胞系

利用CRISPR/Cas9系统建立催产素受体(oxytocin receptor,OXTR)基因敲除的巴马猪胎儿成纤维细胞系(porcine fetal fibroblasts,PFFs),为构建OXTR基因敲除巴马猪模型提供供体细胞。首先,对人和猪的OXTR基因进行了生物学信息分析。其次,利用在线设计工具设计了2个靶向猪OXTR外显子区的sgRNA,并克隆至pX330骨架质粒中,最后将打靶质粒和Neomycin抗性质粒共转染至PFFs中,用G418药物筛选出抗性单克隆细胞,测序鉴定其基因型。生物信息学分析显示人和猪OXTR基因进化距离较近,氨基酸序列一致性达到91%,相似性为93%,三维结构的RMSD值为0.009。成功构建OXTR基因的Cas9/sgRNA打靶载体,转染PFFs细胞后,药物筛选获得OXTR基因敲除的单克隆细胞并测序证实了基因突变型。人和猪OXTR基因具有高度同源性;构建的Cas9/sgRNA表达载体高效实现了OXTR基因编辑,成功获得基因敲除的单细胞克隆,为后续构建OXTR敲除的巴马猪模型奠定了前期基础。     

滇中亚高山地带性植被凋落物分解对模拟氮沉降的响应

模拟氮（N）沉降对凋落物分解特征的影响对研究森林生态系统物质循环响应大气N沉降的内在机理和应对N沉降全球化具有重要意义。从2018年2月至2019年1月，对滇中亚高山常绿阔叶林（Evergreen broad-leaf forest）和高山栎林（Quercus semecarpifolia forest）两种地带性植被进行模拟N沉降试验，利用尼龙网袋法对两种林型凋落叶和凋落枝进行原位分解试验，N沉降处理水平分别为对照CK（Control check，0 g N m^-2 a^-1）、低氮LN（Low nitrogen，5 g N m^-2 a^-1）、中氮MN（Medium nitrogen，15 g N m^-2 a^-1）和高氮HN（High nitrogen，30 g N m^-2 a^-1）。结果表明：常绿阔叶林凋落叶和凋落枝分解率分别为44.84%和21.96%，均高于高山栎林的35.97%（凋落叶）和17.51%（凋落枝）；N沉降处理使得常绿阔叶林和高山栎林的凋落叶和凋落枝质量损失95%的时间在对照（CK）的基础上均有一定程度的增加，其中以HN处理下最为显著；经过1年的分解，两种林型凋落叶、枝纤维素和木质素降解均受到N沉降的抑制作用；两种林型中凋落物质量残留率、纤维素和木质素残留率三者间呈极显著正相关。针对滇中亚高山区域范围内的两种地带性植被，凋落物分解对N沉降的响应方向主要取决于凋落物基质质量，其中尤以纤维素和木质素为重要影响因素。     

TPP1基因慢病毒干扰载体的构建及鉴定

目的:构建抑制TPP1基因的短发夹RNA(sh RNA)干扰载体。方法:以人的TPP1基因为靶序列,设计并合成sh RNA序列TPP1-si1和TPP1-si2,分别与RNA干扰慢病毒载体pll3.7连接,双酶切鉴定质粒得到阳性克隆pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2,经测序正确后将其与慢病毒包装载体(RRE、REV、VSVG)共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染稳定高表达外源TPP1蛋白的HT1080细胞,通过Western印迹检测其对TPP1蛋白表达的抑制效果,并进行比较;将抑制效果好的病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,检测Pot1蛋白在内源TPP1被敲低的情况下能否在端粒定位。结果:经双酶切验证,外源片段成功插入载体pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2中;pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2均能明显抑制TPP1的表达,其中pll-TPP1-si1的抑制效果最好;pll-TPP1-si1病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,经免疫荧光鉴定能够有效抑制内源TPP1的表达,使Pot1不再端粒定位。结论:构建的抑制TPP1基因的sh RNA干扰载体能有效抑制TPP1的表达,为端粒蛋白TPP1功能的研究奠定了实验基础。     

MDM2与端粒保护蛋白1的相互作用及其功能

目的:探究鼠双微体2同源体(MDM2)与端粒保护蛋白1(POT1)在细胞水平是否有相互作用,及其是否发挥E3泛素化连接酶的功能。方法:首先,用蛋白酶体抑制剂MG132处理稳定表达Flag-POT1的HeLa细胞,Western印迹检测Flag-POT1的表达情况;其次,在HeLa细胞中转入外源的Myc-MDM2和Flag-POT1质粒,48 h后收集细胞,通过免疫共沉淀方法验证Myc-MDM2和Flag-POT1是否具有相互作用;再次,在稳定表达Flag-POT1的HeLa细胞中转入Myc-MDM2或MDM2 siRNA,48 h后收集细胞,Western印迹检测Flag-POT1的表达水平。结果:MG132处理后,Flag-POT1的表达量明显升高且有拖尾现象,免疫共沉淀显示Myc-MDM2和Flag-POT1具有相互作用,但无论转入Myc-MDM2还是MDM2 siRNA,Flag-POT1的表达水平没有明显变化。结论:POT1通过泛素化途径降解,MDM2与POT1具有相互作用,但MDM2不是POT1主要的E3泛素化连接酶。     

“血型模型”辅助理论学习

介绍了一种利用常见材料制作而成的“血型模型”,此模型可以直观、形象地模拟血清中凝集素与红细胞表面凝集原特异性结合的凝集反应,帮助学生从分子水平上认识血液凝集反应,了解血型鉴定方法,理解输血原则,对教师教学有一定的借鉴作用。     

航天诱变白桦生长性状分析

对15年生白桦航天搭载家系(HT-1、HT-2、HT-3、HT-4)及地面对照(CK-1、CK-2、CK-3、CK-4)的生长性状进行分析,并利用2年生、5年生及15年生的生长性状拟合生长曲线。结果表明:15年生HT-1和HT-4的树高分别与地面对照家系间差异达到了极显著水平和显著水平。其中,HT-1树高高于地面对照,而HT-4树高则低于地面对照。其余2个航天搭载家系的树高也高于对照家系,但未达到显著水平。随树龄的增长,航天搭载家系与地面对照的部分性状由差异显著变为差异不显著,但整体差异趋势依旧与苗期保持一致。航天搭载白桦家系及地面对照重复力除98-3家系外都属于高重复力水准(>0.5),HT-1树高性状的突变增益最高,为7.31%。以-x+S为标准在HT-1内选择了4株优良单株,最优单株树高比地面对照家系提高了35.29%。通过拟合树高生长曲线预测了树高生长的趋势。     

发状念珠藻NfwspA3基因的克隆及其耐旱能力分析北大核心CSCD

水分胁迫蛋白(WSP,Water stress protein,)在植物耐干旱过程中起着重要作用。发状念珠藻具有极强的耐旱、耐盐和抗辐射等能力。本研究以发状念珠藻基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆到一个发状念珠藻水分胁迫蛋白基因的开放阅读框(ORF)序列,命名为NfwspA3,其序列全长1017 bp。生物信息学预测表明,该基因可编码338个氨基酸残基,预测等电点为4.85,分子量为37.48 kD,为亲水性稳定蛋白,分布在细胞质中。构建了NfwspA3基因的重组表达菌株pET32aNfwspA3,以聚乙二醇-6000(PEG-6000)对其模拟干旱胁迫,发现重组菌株最高可忍耐60%浓度的PEG-6000,表现出较强的耐旱性,且具有较高的半乳糖苷酶活性。研究结果为探知发状念珠藻WSP蛋白逆境响应机制及其遗传改良提供了理论依据和基因元件。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除长非编码RNA SNHG16基因促进K562细胞CD235a的表达上调

为了探究敲除长非编码RNA SNHG16对人慢性髓系白血病K562细胞的影响,我们利用CRISPR/Cas9技术在K562细胞中敲除SNHG16基因,通过流式分选获得单细胞,经扩增培养、基因组PCR鉴定、测序鉴定后,获得SNHG16杂合和纯合敲除株;通过Wright-Giemsa染色、MTS检测、流式分析和qRT-PCR分别检测了SNHG16敲除后对K562细胞形态、增殖、细胞表面标志蛋白及红系分化调控因子的影响。实验结果显示,敲除SNHG16后不影响K562细胞的形态和增殖,显著促进了K562细胞表面标志蛋白CD235a和红系分化调控因子的表达水平。该研究表明,长非编码RNA SNHG16不影响K562细胞的增殖,但SNHG16对K562细胞表面标志蛋白CD235a的表达水平有一定的调控作用。     

异叶天南星苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与蛋白结构分析

以异叶天南星(Arisaema heterophyllum Blume)为材料,采用逆转录PCR(RT-PCR)法扩增其苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因Ah PAL,获得该基因的开放读码框(ORF),并通过系统的生物信息学软件分析Ah PAL的结构和理化性质。结果显示,Ah PAL的ORF全长为2184 bp,编码727个氨基酸;Ah PAL与郁金香(Tulipa fosteriana W. Irving) PAL的亲缘关系最近,序列相似性达88%。空间结构模型分析结果显示,Ah PAL为同型四聚体,每个单体由3个结构域组成,其中MIO结构域含有PAL酶家族的保守序列和Ala-Ser-Gly三肽活性中心,是Ah PAL酶活性的决定性结构域。利用荧光定量PCR方法检测3个Ah PAL Unigene在根、块茎和叶中的表达情况,发现它们在根中表达量均最高,而在叶和块茎中表达较低。