兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析

应用RT—PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1．7kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEM^R—T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆,序列分析表明扩增的中国株BHD衣壳蛋白基因片段长度为1740bp,共编码580个氨基酸。该核酸序列与其它国家报道的多株BHDV序列相互间同源性高达98．2％一99．0％,其推导的氨基酸序列同源性也达98．3％--99．1％,为极度保守片段。     

马立克氏病病毒38 kd磷蛋白H19-和T65-抗原表位分析及鸡对该抗原表位点突变病毒的免疫反应

对马立克氏病病毒(MDV)38 kd 磷蛋白(pp38)基因的编码序列的测定表明, 所有在间接荧光抗体试验(IFA)中与单抗H19反应的10个不同致病型MDV毒株, 在第320位碱基为“A”, 相应第107位氨基酸是谷氨酰胺, 而在IFA中不与单抗H19反应的疫苗株CVI988相应位点分别是“G”和精氨酸. 另一方面, 在IFA中能与另一个单抗T65反应的毒株, 在第326位碱基是“G”, 第109位氨基酸是甘氨酸, 而其他不与单抗T65反应的毒株, 相应位点碱基和氨基酸分别是“A”和谷氨酸. 通过比较CVI988及其在pp38基因的第320和326位的单一或双碱基点突变病毒CVI988/rpp38(AG)和CVI/rpp38(AA)对H19和T65的反应性, 证明了在第107和109位的谷氨酰胺和甘氨酸分别对pp38上的H19和T65两个抗原表位起关键作用. 比较CVI988及其点突变株CVI/rpp38(AG)在SPF鸡诱发的抗体反应表明, 接种了点突变株CVI/rpp38(AG)鸡的抗体反应出现得比天然株抗体反应明显延缓且显著降低. 进一步对MDV不同抗原成分的相应抗体水平比较表明, 该功能区内可能存在着第3个特异性抗原表位, 它决定于CVI988株pp38第107位的精氨酸, 而且天然CVI988株及其点突变株诱发的抗MDV抗体水平间的显著差异可能正与这个抗原表位相关.     

动物病毒传染性克隆技术研究进展

综述了6种动物病毒传染性克隆技术:重组质粒转染子挽救系统,PolI PoⅡ转录挽救系统,Bac操作系统,Cosmid操作系统,YAC操作系统以及Bacmid操作系统;涵盖了动物RNA病毒,DNA病毒以及昆虫杆状病毒;比较了各系统的优缺点和适应范围,指出了动物传染性克隆技术的应用前景.     

Ⅰ型马立克氏病病毒pp38和pp24基因的真核共表达

本研究将Ⅰ型超强毒MDV Md11株的pp38和pp24完整基因分别克隆到真核双表达载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过间接免疫荧光试验(IFA)用单克隆抗体H19和鼠抗GST-pp24血清分别检测到了pp38和pp24基因的单独表达.然后将MDV Md11株的pp38和pp24完整基因同时克隆到载体pBudCE4.1中,在脂质体作用下将阳性克隆DNA转染CEF,通过IFA检测和用抗pp24多克隆血清进行Western-blotting试验检测到了PP38和PP24磷蛋白的共表达.     

马立克氏病病毒pp38基因和1.8kb转录子之间双向启动子的特性研究

从马立克氏病病毒(MDV)基因组DNA复制原点区某一点,将介于MDV pp38基因和18kb转录子之间的双向启动子分割成两个单方向的启动子。以pp38为报告基因,pUC18质粒为载体,构建了含不同方向完整启动子序列的pProfpp38和 pProrpp38质粒,以及含分割后单方向启动子序列的pdProfpp38和pdProrpp38质粒。4种质粒分别转染鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblast, CEF）后,均能检测到pp38基因的表达。进一步以氯霉素乙酰转移酶（Chloramphenicol acetyltransferase, CAT）为报告基因,构建了含不同方向完整双向启动子的pProfCAT和 pProrCAT质粒,以及含分割后单方向启动子序列的pdProfCAT和 pdProrCAT质粒。通过转染试验,定量分析了完整启动子和分割后启动子在两个方向上的启动活性。实验结果表明,分割后的启动子在两个方向上的启动活性均比相应方向上完整启动子的活性低,其中1.8kb转录子方向上的活性下降了41倍。     

猪传染性胸膜肺炎病料中PCV_2和PRRSV的PCR检测

应用PCR方法对从山东省不同地区采集的253份猪传染性胸膜肺炎肺脏和125份临床健康猪肺脏进行PCV_2和PRRSV的检测。结果显示,在传染性胸膜肺炎猪肺脏中,171份为PCV_2阳性,阳性率达67.5％;101份样品为PRRSV阳性,阳性率达40%;其中,68份样品同时检出PCV_2和PRRSV,共感染阳性率达26.8%。而临床健康猪肺组织中,21份样品PCV_2检测结果为阳性,阳性率为16.8％;12份样品PRRSV检测结果阳性,阳性率为9.6％,PCV_2和PRRSV共感染未检出。统计结果显示,传染性胸膜肺炎发病猪与临床健康猪PCV_2、PRRSV及PCV_2和PRRSV共感染的阳性率差异极显著,传染性胸膜肺炎发病猪的肺脏中PCV_2和PRRSV的检出率明显高于临床健康猪。上述检测结果提示,猪传染性胸膜肺炎的发生可能与PCV_2和PRRSV的感染和共感染有关。     

传染性法氏囊病不同代次细胞毒免疫效果的研究

将从山东省东营分离到的1株传染性法氏囊病病毒(IBDV)野毒(暂命名 IBDV SDDY株,经鉴定该株与 IB DV STC株具有较高的同源性)经 SPF 鸡胚传代,然后转为细胞培养,取第 20 代、21 代、25 代毒,以 1 倍剂量(3000TCID50/0.2mL )和5倍剂量不同的免疫剂量,分别在7日龄、14日龄对商品代海蓝褐蛋鸡进行免疫,并于免疫前用 IBD ELISA试剂盒检测 IBDV母源抗体水平,于 35 日龄用传染性法氏囊病病毒超强毒 (very virulent In fectious Bursal Disease Virus, vvIBDV )GX 8/99攻毒,在攻毒前再次检测IBDV的抗体水平,攻毒后观察记录各分组鸡的致病率和死亡率,并计算免疫器官体重指数,观察免疫器官的组织损伤情况。试验结果表明:3 代毒都具有较高免疫原性,但是20代毒仍具有较大的毒性,7 日龄接种会引起法氏囊的萎缩,造成持续的组织损伤;21 代毒、25代毒保护率高,无免疫抑制,是比较理想的疫苗来源;7日龄免疫较14日龄免疫更易造成组织损伤和免疫抑制,14日龄免疫较为合适。     

马立克氏病病毒Md11株pp24基因的原核表达

通过PCR方法扩增MDV Md11株pp24基因的完整ORF,按正确的阅读框架将其克隆入原核表达载体pGEX-6P-1中,重组质粒转化BL21宿主菌后,经IPTG诱导表达.诱导菌体裂解物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后,用山羊抗GST抗体进行Western-blotting试验,结果确证了GST-pp24融合蛋白的表达.将表达产物从凝胶中回收,免疫4周龄小白鼠,3次免疫后,采血分离血清.所得抗GST-pp24多克隆抗血清分别与GA株、Md11株和CVI988株MDV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)进行间接免疫荧光试验(IFA),结果表明大肠杆菌表达的pp24融合蛋白至少保留了部分天然pp24蛋白的抗原性.     

特超强毒648株马立克氏病病毒的囊膜糖蛋白gE基因的克隆和序列比较

鸡马立克氏病毒特超强毒 (vv+MDV) 648株的囊膜糖蛋白 gE基因经PCR扩增并克隆入pUC1 8载体。 648株gE基因经核酸序列分析测定 ,全长为 1 494碱基。所编码的蛋白具有跨膜糖蛋白的一些特征。它含有 8个潜在的糖基化位点、N端有一段疏水区 (1～ 1 9aa)所构成的信号肽、C端有一段疏水区 (391～ 41 9aa)所构成的膜锚着序列。经 648株 (vv+MDV)和马立克氏病毒强毒 (vMDV)GA株的 gE相比较 ,在MDV血清 1型中 gE是较为保守的 ,二者仅有 2个核苷酸的差异 (第 51 2位、第 1 472位 ) ,并导致了有二个相应的氨基酸的改变 (第1 71位Leu/Pro、第 491位Arg/Lys)。     

决定抗原表位特异性的氨基酸组成

所有蛋白质抗原表位既有其相对保守的氨基酸序列作为与相应ＭＨＣ分子相结合的“锚点”,也有与特定溶细胞性Ｔ细胞（ＣＴＬ）上的ＴＣＲ要子或抗体他子特异性结合的特异性氨基酸序列。对前者,分子免疫学已积累了相当多的资料,但对后者尚少有报道。我 立克病病毒的９个不同毒株对２个单抗的反应性及其３８ｋＤ磷蛋白基因的分析,确定了决定两个相叠的不同抗原表们特异性的氨基酸组成。