基于PAT的PCV2 VLPs生产过程优化与控制研究

昆虫细胞-杆状病毒载体表达系统(baculovirus expression vector system,BEVS)是病毒样颗粒亚单位疫苗(virus like particles,VLPs)的理想生产平台。动物细胞培养过程分析技术(process analytical technology,PAT)研究的重点在于更多地获取与细胞生理状态相关的过程参数,以及实现过程敏感参数的在线表征和过程控制关键时间节点的在线判定,从而指导过程优化和控制。通过昆虫Sf9细胞的分批和补料悬浮培养,发现细胞代谢活性与在线特征频率(fc)之间存在相关性。以fc作为细胞代谢活性的在线指征,在细胞代谢活性下降之前补料,使得Sf9细胞在代谢活性明显增强的基础上,最高活细胞密度提高1.75倍。通过分批培养与补料分批培养过程细胞生理特性参数的相关性分析,发现比电容增长速率(με)与培养体系S-期细胞比例之间存在相关性,με作为细胞增殖活性状态的在线指征参数,可以作为最佳接毒时间的判定依据。此外,研究还发现在线检测参数电容(ε)与最高疫苗产量之间存在相关性,可以作为疫苗最佳收获时间的在线表征参数。以在线fc值作为补料时间指征,以在线με值作为病毒感染时间指征,以在线ε值作为病毒收获时间指征,实现了猪圆环病毒2型(PCV2)VLPs的高效生产。相比于批培养,基于PAT的生产工艺疫苗单位体积产量提高76%,生产周期缩短了24h,为PCV2病毒样颗粒亚单位疫苗大规模生产提供了一种新的高效生产模式。     

miR-203下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化

目的:验证miR-203通过与TLR4 mRNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。方法:通过miRanda软件预测TLR4 mRNA 3'-UTR存在mi R-203结合位点。根据TLR4 mRNA 3'-UTR序列设计目的基因片段以及突变型目的基因片段,以pmirGLO为载体构建双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-TLR4 3'-UTR)及其突变型载体(pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR)。将293T细胞共转染pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒或pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-mi R-203-3p mimics或mimic NC,通过双荧光素酶报告基因系统验证mi R-203可以与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合,通过Real-time PCR及Western blot验证小鼠巨噬细胞RAW264.7转染了mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC后,M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23),M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。使用TLR4抑制剂TAK-242抑制小鼠巨噬细胞TLR4-Myd88-NF-κB信号通路后,转染mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC,再次检测M1,M2型巨噬细胞markers及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。结果:双荧光素酶报告基因系统显示293T细胞转染了pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-miR-203-3p mimics后,其相对荧光素酶活性△CT较转染了pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒或者mimic NC均有显著降低,其差异达到统计学意义(P0.05)。Real-time PCR及Western blot显示转染了mmu-miR-203-3p mimics的小鼠巨噬细胞M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23)表达减少,M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)表达增加,同时伴有TLR4-Myd88-NF-κB信号通路表达下调,而通过给予TAK-242抑制了mmu-miR-203-3p mimics下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路及诱导M2型巨噬细胞极化的作用。结论:mi R-203与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。     

Relationship between uterine expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors and endometrial receptivity

In order to investigate the relationship between the endometrial receptivity and matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1,-3 (TIMP-1,-3) in the endometrium, we used early pregnant mice as the animal model and studied the expression of MMP-2, TIMP-1,-3 in the endometrium in relation to the number of implantation sites after RU486 treatment. The results indicated that RU486 could significantly inhibit embryo implantation and change the expression of MMP-2 and TIMP-1,-3 in a dose-dependent pattern. When the mice were treated with 12 mg/kg RU486, there were a few embryos implanted as compared with the control. The expression of matrix metalloproteinase MMP-2 was low during the period of "implantation window", while the tissue inhibitor of metalloproteinase in the endometrial cells was high, suggesting that the activity of the proteolytic enzyme was strictly controlled by its inhibitors. After RU486 treatment, the generation of TIMP-1,3 was decreased while the MMP-2 was significantly increased, indicating that the normal balance between the activators and their inhibitors in the tissue was broken and the extracellular matrix was excessively degraded, subsequently the embryo implantation was inhibited. Therefore, it is suggested that the anti-implantation effect of RU486 may be mediated by MMPs and their inhibitors TIMPs.     

应用线性硅电极阵列检测海马场电位和单细胞动作电位

近年来,硅材料微电极阵列发展迅速,μ为研究大脑神经细胞活动的时空特性提供了理想的手段.考察了线性硅材料微电极阵列在神经细胞电位检测中的稳定性,以及对于单细胞动作电位检测的有效性.实验结果表明,在麻醉大鼠海马CA1区场电位记录中,上下移动记录微电极200μm,对于正向和反向诱发电位的记录几乎没有影响,说明,线性微电极阵列对于神经细胞的损伤很小,检测性能稳定.电极阵列上处于细胞胞体层的测量点可以有效地记录到CA1神经细胞的动作电位发放,同一记录点上可以清楚地分辨出数个不同神经细胞的发放电位.实验结果显示了硅电极阵列操作简便、检测信号稳定和获取信息多等特点,对于开展微电极阵列应用研究的工作人员具有借鉴作用.     

D-氨基酸在细菌生理中的结构性能和调节功能的研究进展

除最小的甘氨酸外,所有的氨基酸(amino acid,AA)都有手性,以D-氨基酸(DAA)或L-氨基酸(LAA)形式存在。DAA广泛存在于各类生物中,尤其是细菌。DAA虽没有参与蛋白质合成,但DAA尤其是非典型DAA在细菌生理中具有很多特殊功能。在结构性能方面,DAA是细菌细胞壁肽聚糖的重要组分,并参与组成某些非核糖体合成途径产生的生物多肽,少数细菌能产生含有D-Glu的γ-聚谷氨酸。对细胞个体而言,DAA能调节细菌表面电荷和自溶素活性,抑制细菌芽胞萌发,调节稳定期细胞壁的重塑及调节病原菌的毒力等。对细菌群落而言,DAA对生物膜的解聚和细菌生态也具有调控作用。此外,某些DAA还能直接作为营养支持某些细菌的生长,而有的DAA则具有抑菌作用。本文主要综述了DAA在细菌生理过程中发挥多项功能的研究进展。     

CO2激光在拔牙创止血作用的临床观察

拔牙术后出血是一种最常见的并发症。在如何减少病人术后出血以及促进伤口愈合方面,仍是齿槽外科的研究课题。我科应用CO_2激光烧灼拔牙创及牙槽窝内渗血的方法,经临床观察,止血作用明显,效果良好。故报道如下。 资料与方法     

基于遥感数据的植被碳水利用效率时空变化和归因分析

植被碳水利用效率是表征生态系统碳水循环的重要指标。采用MODIS数据,利用Google Earth Engine平台计算植被碳利用效率(Carbon Use Efficiency, CUE)与水利用效率(Water Use Efficiency, WUE)。采用趋势分析、变异系数、R/S分析及偏相关分析等方法,对2000—2020年黄河流域植被CUE与WUE的时空动态进行分析,并探究水热条件对碳水利用效率的影响。结果表明：(1)2000—2020年黄河流域植被碳水利用效率年均值分别为0.61和0.68 gC m^-2 mm^-1;研究时限内,植被CUE呈波动下降趋势,而WUE呈波动上升趋势。(2)空间上,植被CUE呈西高东低分布,WUE相反。不同土地覆被类型的CUE表现为草地>农田>灌丛>森林;WUE表现为：农田>森林>草地>灌丛。(3)总体上,黄河流域植被CUE与温度呈负相关,与降水呈正相关;黄河流域北部植被WUE与温度和降水均呈正相关关系,黄河流域西南部植被WUE与降水负相关;(4)不同土地利用类型中,草地...     

湖南东部植被恢复对土壤有机碳矿化的影响

为阐明中亚热带植被恢复对土壤有机碳(SOC)稳定性的影响机制, 采用空间代替时间方法, 在湘东丘陵区选取檵木(Loropetalum chinense)-南烛(Vaccinium bracteatum)-杜鹃(Rhododendron simsii)灌草丛(LVR)、檵木-杉木(Cunninghamia lanceolata)-白栎(Quercus fabri)灌木林(LCQ)、马尾松(Pinus massoniana)-柯(Lithocarpus glaber)-檵木针阔混交林(PLL)、柯-红淡比(Cleyera japonica)-青冈(Cyclobalanopsis glauca)常绿阔叶林(LAG)作为一个恢复系列, 采用室内恒温培养(碱液吸收法)测定SOC矿化速率及其累积矿化量(C_m), 结合主成分和逐步回归方法分析C_m、SOC矿化率与植被因子和土壤因子的关系。结果表明: (1)不同植被恢复阶段SOC矿化速率随着培养时间呈现基本一致的变化趋势, 培养初期矿化速率较高, 且快速下降, 培养中后期缓慢下降并趋于平稳, 倒数方程能很好地拟合不同植被恢复阶段SOC矿化速率与培养时间的关系。(2)植被恢复显著提高各土层SOC矿化速率和C_m, LAG显著高于其他3个植被恢复阶段, LAG 0-40 cm土层C_m比LVR、LCQ、PLL分别高出359.06%-716.31%、112.38%-232.61%、94.40%-105.74%。(3) 4种植被恢复阶段0-10、10-20、20-30、30-40 cm土层SOC矿化率分别为2.13%-4.99%、3.42%-4.18%、4.05%-4.64%、4.02%-5.64%, 但不同植被恢复阶段之间差异不显著。(4)植被恢复过程中, C_m的变化主要受土壤全氮(TN)含量、根系生物量的驱动, 土壤TN含量、根系生物量可分别解释C_m变异的96.9%、0.9%。而土壤C:N是SOC矿化率的主要调控因子, 可单独解释SOC矿化率变异的49.4%。表明植被恢复促进了SOC矿化, 降低了SOC中矿化C的比例, 有利于提高土壤固C能力; 随着植被恢复, 土壤TN含量和根系生物量增加是影响C_m的主要因子, 而土壤SOC的质量差异是影响SOC矿化率的主要因子。     

絮凝菌株Shinella sp. xn-1对铜绿微囊藻的絮凝效果

【目的】研究絮凝功能细菌xn-1对有害水华藻——铜绿微囊藻的絮凝效果,以期为有害水华的治理提供新的选择。【方法】采用涂布划线法从藻际分离纯化絮凝功能微生物;基于16S r RNA基因序列确定进化地位;通过不同金属离子确定絮凝机制;梯度醇沉法获得絮凝物质;以酶标仪测定絮凝效率。【结果】菌株xn-1确定属于申氏杆菌属(Shinella),且命名为Shinella sp.xn-1。在添加Ca~(2+)作为促凝剂的条件下对铜绿微囊藻表现出高效的絮凝效果,其絮凝效果主要来源于胞外上清,而表现出高效的絮凝效果所需要的胞外上清添加量为3.0%。从胞外上清中获得的絮凝物质以0.5 g/L的添加量作用于藻细胞后表现出高效的絮凝效果,且随着处理时间增加,絮凝团的体积增大。【结论】Shinella sp.xn-1通过分泌胞外絮凝物质对铜绿微囊藻表现出高效的絮凝效果,在絮凝作用下藻细胞聚集在一起形成大体积的絮凝团,该研究有利于治理有害水华。     

北京地区黄檗分布与环境因子的关系

黄檗（Phellodendron amurense Rupr.）为我国二级重点保护野生植物,在北京地区黄檗多散生于阔叶林中,数量稀少。为了解北京地区黄檗分布与环境因子的关系,促进种群扩繁,在北京百花山、松山和雾灵山自然保护区共设置了12个20 m×20 m的样地,利用CCA分析方法对不同地点黄檗的生长分布状况与海拔、坡度、坡向、郁闭度、土壤pH值、碱解氮和土壤有机质等11个环境因子的关系进行了分析。结果显示,CCA排序第一轴主要反映了海拔、郁闭度和坡度的变化,第二轴主要反映了有机质含量、碱解氮含量、pH值和坡向的变化,其中海拔、碱解氮和土壤有机质是影响黄檗生长分布的重要环境因子,低海拔、低碱解氮含量以及土壤有机质高的地段适宜黄檗分布。对影响黄檗分布的环境因子进行定量分离,结果发现环境因子对黄檗样地物种分布的解释能力为84.5%,显示出较好的排序效果,黄檗分布点受人为干扰较少,其所在植物群落与环境保持了良好的对应关系;环境因子与物种分布呈显著相关（P=0.03）,表明CCA排序结果可以解释环境因子对物种分布的影响程度。