人血小板生成素 cDNA 合成、克隆及序列测定

利用ＲＴ－ＰＣＲ方法从中国人胎肝总ＲＮＡ中扩增出人血小板生成素（ｈＴＰＯ）的ｃＤＮＡ。序列分析结果表明,我们所获得的ｈＴＰＯ ｃＤＮＡ与献报道中的基因序列高度同源,其中第４９７ｂｐ、５９５ｂｐ、７６７ｂｐ和７９５ｂｐ位碱基分别由Ｔ、Ｇ、Ｔ和Ｔ代替了献中的Ｇ、Ａ、Ｇ和Ｃ,从而导致了１６６、１６９和２５６位氨基酸由报道中的Ｓｅｒ、Ｌｙｓ和Ｇｌｙ变为Ｐｈｅ、Ｇｌｕ和Ｖａｌ。     

茄子花叶病新毒原

１９９１年从沈阳地区茄子花叶病叶片中分离到了ＳＹ－Ｉｓ分离物。经汁液摩擦接种７个科１６种植物,这一分离物可浸染４个科８种植物,但不侵染黄瓜、两葫芦和蚕豆,也不能经桃蚜和萝卜蚜传播。该分离物体外抗性的致死温度（ＴＩＰ）为９０－９５℃;稀释限点（ＤＥＰ）为１０￣（－６）－１０￣（－７）;体外保毒期（Ｌ）为一个月以上。光学显微镜下可见晶状胞质内含体。叶滴法电镜观察可见大小为±３００×１８ｎｍ的杆状病毒粒子。该病病叶汁液与烟草花叶病毒（ＴＭＶ）普通株抗血清呈明显阳性反应。用ＴＭＶ的一对引物进行多聚酶链反应（ＰＣＲ）,可扩增出一特异性核酸片段。根据上述实验结果,我们认为引起沈阳地区茄子花叶病的毒原种类为ＴＭＶ,是茄子花叶病的新毒原。     

小球藻NADP-谷氨酸脱氢酶的cDNA克隆及转基因烟草分析

用RT-PCR方法从小球藻(Chlorella sorokiniana)中克隆了铵诱导表达的以辅酶Ⅱ为辅基的谷氨酸脱氢酶(NADP-GDH)基因的cDNA片段,DNA测序分析表明与已报道的该基因c DNA序列同源性为94%.将NADP-GDH基因先插入到SPDK621质粒的2CaMV35S启动子和Ω增强序列之后,然后将2CaMV35S-Ω-GDH-NOS表达单元构建到RokⅡ质粒的HindⅢ与Eco RⅠ之间,从而获得高效植物表达载体.将RokⅡ-GDH质粒转移到根癌土壤杆菌(Agro bacterium tumefaciens (Smith et Townsend) Conn) EHA105中,对烟草(Nico tiana tabacum L.)进行转化并得到阳性转化后代.对转基因烟草分析表明,在低氮培养基或在低氮蛭石中其生长速度和叶片数明显高于对照;铵毒性实验表明,无论在低铵或高铵条件下,接种在MS固化培养基上的转基因绿叶圆片存活时间长,叶绿素含量高.这些结果说明外源NADP-GDH增强了植物对氮素的吸收和利用.另外,转化后代还表现了对除草剂膦化麦黄酮(PPT)具有较强的抗性;培养在含有不同浓度PPT的MS固化培养基上的转基因绿叶圆片,其愈伤化程度明显高于对照;在MS培养基中用0.5 μg/mL 的PPT可以代替卡那霉素对转化后代进行筛选,这暗示 NADP-GDH基因可以作为一种新的选择标记用于植物基因工程的研究.     

人朊病毒蛋白及其突变体的溶剂可及性和模拟分析

朊病毒是一种全新类型的致病因子,以一种全新的致病机制造成许多神经退化性疾病。它的致病性主要由于PrP^C向PrP^Sc构象转变而造成。为了探讨PrP^C向PrP^Sc转变过程中PrP分子构象变化的机制,我们计算分析了人天然PrP分子及不同的单残基突变体(如M166V,S170N,E200K和R220K)的氨基酸残基溶剂可及性,并对天然PrP分子及其突变体进行了结构重叠模拟RMS偏量分析。结果表明：由于166位等单个残基的突变,造成PrP突变体与天然蛋白的局部结构出现较大差别,使得部分残基的溶剂可及表面积发生了较大变化,并且部分残基改变了它们的位置,同时也影响蛋白质表面的电倚分布,这些改变是为了更好地适应次级相互作用的局部环境。分析表明PrP与一般球蛋白在性质上有一定的差异,说明PrP分子并不是一种稳定的球蛋白结构,只是一种折叠中间物。     

棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白基因5′端截短片段的表达及增效活性测定

将带有棉铃虫颗粒体病毒增效蛋白 (HaGVenhancin)基因的重组表达载体 pET 30a En分别用BalⅠ和DraⅠ酶切后连接 ,构建重组表达载体pET 30a Ben和 pET 30a Den ,其外源基因的开放阅读框分别为HaGV增效蛋白基因 5′端的 1 7kb和 2 2kb。IPTG诱导表达产生 66 7kD和 85 1kD的多肽并命名为Ben和Den。初步纯化的Ben和Den显示了对棉铃虫核多角体病毒 (HaNPV)及Bt的增效活性。Ben可对棉铃虫核多角体病毒增效 1 0 5%～2 6 5% ,LT50 缩短 0 9d ,Den增效 1 0 2 %～ 33 0 % ,LT50 缩短 1 2d～ 1 9d。重组增效蛋白可对Bt(1∶2 50 0稀释 )增效 2 0 7%～ 35 4% ,Den增效 1 6 7%～ 31 5% ,Ben增效 1 1 7%～2 7 4%。这为进一步研制抗虫工程菌打下了良好的基础     

中国南瓜曲叶病毒DNAA的克隆及其全序列

对引起我国南瓜曲叶病的病毒分离物DNA的克隆和序列分析表明,中国南瓜曲叶病毒DNA A由2741个核苷酸组成,共编码6个开放阅读框(ORF),其中病毒链有2个ORF：AV1(256aa)和AV2(140aa),AV1为外壳蛋白基因;病毒链的互补链有4个ORF,AC1(243aa)编码复制酶基因,AC2(134aa)编码反式激活蛋白,AC3(136aa)和AC4(172aa),该病毒属于旧世界Begomoviruses,是一个粉虱传播的联体病毒。     

特异切割12-脂加氧酶mRNA的核酶体外活性及动力学研究

根据锤头状核酶(Ribozyme)的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割12-脂加氧酶(12-LO)mRNA的核酶基因。以合成的25个核苷酸长的12-脂加氧酶RNA片段为底物与转录的核酶RNA一起保温检测其体外切割活性。实验结果表明,在37℃保温时,核酶在体外对12脂加氧酶具有较高的特异切割活性,其Km值为1300 nmol/L,其kcat值为0.083/min,在50℃保温时,核酶具有很高的切割活性,其kcat值为0.31/min。     

特异切割12-脂加氧酶mRNA的核酶体外活性及动力学研究

根据锤头状核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割１２－脂加氧酶（１２－ＬＯ）ｍＮＲＡ的核酶基因。以合成的２５个核苷酸长的１２－脂加氧酶ＲＮＡ片段为底物与转录的核酶ＲＮＡ一起保温检测其体 割活性。实验结果表明,在３７℃保温时,核酶在体外对１２－脂加氧酶具有较高的特异切割活性,其Ｋｍ值为１３００ｎｍｏｌ／Ｌ,其ｋｃａｔ值为０．０８３／ｍｉｎ,在５０℃保温时,核酶具有很高的切割