CH50真核表达载体pCH503的构建及小鼠体内表达的趋化与抗肿瘤活性

构建重组 FN多肽 CH50真核表达载体并在小鼠体内表达 ,研究其趋化与抗肿瘤作用 .采用重组 DNA技术构建表达质粒 ;体内进行基因转染 ,采用 RT- PCR鉴定导入基因的表达 ;通过肝素亲和层析、SDS- PAGE和 Western blot鉴定表达产物 ;腹腔细胞计数、Giemsa染色分析以及肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用 ;小鼠黑色素瘤模型研究基因转染抑制肿瘤的作用 .从 CH50原核表达载体获得重组多肽的 c DNA,5′端加上小鼠 IFN- 5′端非编码区和信号肽编码区的 c DNA,3′端加上人 FN c DNA的 3′端非编码区 ;将重组 c DNA插入 p REP8质粒 ,即构建出p CH50 3质粒 .巨噬细胞在体内经 p CH50 3转染 ,然后在体外培养 ,能够产生 CH50多肽 .以p CH50 3分别进行腹腔基因转染和肌肉内基因转染 ,均可对免疫细胞产生趋化作用 ;p CH50 3体内转染可以使小鼠腹腔内黑色素肿瘤结节数降低 50 %～ 60 % . CH50真核表达载体 p CH50 3可在小鼠体内表达 ,体内基因转染可趋化免疫细胞和抑制肿瘤结节形成 ,在肿瘤综合治疗中有重要意义 .     

CH50真核表达载体pCH503的构建及小鼠体内表达的趋化与抗肿瘤活行

构建重组FN多肽CH50真核表达载体并在小鼠体内表达,研究其趋化与抗肿瘤作用.采用重组DNA技术构建表达质粒;体内进行基因转染,采用RT-PCR鉴定导入基因的表达;通过肝素亲和层析、SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物;腹腔细胞计数、Giemsa染色分析以及肌肉组织切片与染色观察体内基因转染后的趋化作用;小鼠黑色素瘤模型研究基因转染抑制肿瘤的作用.从CH50原核表达载体获得重组多肽的cDNA,5＇端加上小鼠IFN-γ5＇端非编码区和信号肽编码区的cDNA,3＇端加上人FN cDNA的3＇端非编码区;将重组cDNA插入pREP8质粒,即构建出pCH503质粒.巨噬细胞在体内经pCH503转染,然后在体外培养,能够产生CH50多肽.以pCH503分别进行腹腔基因转染和肌肉内基因转染,均可对免疫细胞产生趋化作用;pCH503体内转染可以使小鼠腹腔内黑色素肿瘤结节数降低50%～601.CH50真核表达载体pCH503可在小鼠体内表达,体内基因转染可趋化免疫细胞和抑制肿瘤结节形成,在肿瘤综合治疗中有重要意义.     

基于丹参基因组的COI1基因抗虫与次生代谢调控功能研究

本草基因组学极大地推动了药用植物分子育种、次生代谢网络调控和品质成因等研究的进程.本研究基于本草基因组学,从模式药用植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)基因组中克隆丹参COI1(SmCOI1)基因并初步分析其蛋白特征及表达模式.利用RNAi技术获得丹参COI1沉默株系(iCOI1).抗虫性检测结果显示,与对照相比iCOI1株系叶片损伤指数上升,对昆虫咬噬耐受性减弱;同时,抗性相关基因WKRY70和NPR1的表达量在iCOI1株系中显著降低.进一步检测iCOI1株系中主要次生代谢产物合成与积累情况,结果表明iCOI1株系中迷迭香酸、丹酚酸B、隐丹参酮及丹参酮ⅡA的含量较野生型显著降低,其生源合成途径中的关键酶基因C4H,RAS,HCT,HMGR,GGPPS,CPS,KSL,CYP76AH1的表达量较野生型显著下调,且与丹参COI1的沉默显著正相关.上述结果表明,丹参COI1基因参与调控丹参抗虫性及主要次生代谢产物合成和积累过程.本研究为丹参抗性研究和次生代谢过程调控提供理论依据,也为优质高产药用植物品种选育奠定了基础.     

一种转移非特异性蛋白带的染色方法

考马斯亮蓝是常用的聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳的染料,利用硝酸纤维素膜(NCF)对染料的吸附作用,将低浓度的考马斯亮蓝(0.025%)染色液直接对NCF上的转移蛋白带进行染色,经实验反复验证.它是一种较好的NCF上转移非特异性蛋白带的染色方法.     

双价和双特异性Diabody的构建及表达

单链抗体(ScFv)是由一个重链可变区(V_H)、一个轻链可变区(V_L)经连接肽(linker)连在一起构成的单价小分子抗体,为使其能组装成双价,我们对一个抗人红细胞的ScFv进行了改造,将其连接肽由17个氨基酸[SR(GGGGS)_3]缩短为6个氨基酸(SRGGGS),强迫不同分子间的V_H和V_L组合成F_V,从而形成双价小分子抗体(Diabody),在大肠杆菌中分泌表达后,显示:①具有血球凝集活性:抗人RBC ScFv虽可与RBC结合,但不能产生凝集     

脑源神经营养因子基因转染神经断端促进切断坐骨神经再生

为了研究体内表达的脑源神经营养因子（Ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄＮｅｕｒｏｔｒｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＢＤＮＦ）对脊髓运动神经元存活及切断神经再生的作用,我们将人ＢＤＮＦｃＤＮＡ克隆到真核表达载体ｐＣＢ６中,使ＢＤＮＦ基因在ＣＭＶ启动子控制下表达。在雏鸡出生后３小时内及第二天直接将ｐＣＢ－ＢＤＮＦｃＤＮＡ·ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ混合物注射到坐骨神经预切断位点附近肌肉内。第二天切断坐骨神经,神经切断１０天后进行实验检测,观察到,ＢＤＮＦｃＤＮＡ转染阻止了切断神经一侧的腰脊髓内（Ｌ４－Ｌ６）运动神经元的大量死亡。并显著的促进了切断坐骨神经的再生。这些结果表明直接注射含ＢＤＮＦｃＤＮＡ的质粒对损伤的神经进行基因治疗,具有良好的前景;ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导重组质粒进行基因转染是导入外源基因到体内的一个可行方法。     

谷类作物半粒种子的PCR分析及其在标记辅助选择育种中的应用

建立了适于种子nNA分析的快速简便的PCR方法。水稻、小麦和玉米的半粒种子用提取缓冲液处理,产生的提取液可用于PCR和RAPD分析。水稻半粒种子的DNA和来自叶片的DNA用专一的PCR引物扩增后可以产生同样的PCR产物。含有胚的另半粒种子可以正常发芽。将半粒种子的PCR分析方法用于水稻白叶枯病抗性基因型的鉴定,证明是植物育种和遗传学研究中一种非常实用的方法。     

丹参bHLH转录因子基因SmMYC2的克隆和表达分析

MYC2是植物茉莉酸类激素响应途径中的核心转录因子,在植物防御反应、次生代谢调控及生长发育过程中均有重要的调控作用。基于丹参转录组和基因组survey序列,本研究克隆了丹参转录因子MYC2的基因序列,并命名为Sm MYC2(Gen Bank No.KJ945636)。Sm MYC2基因的c DNA序列长度为1910 bp,开放阅读框(ORF)的长度为1809 bp,编码602个氨基酸,无内含子;该基因编码蛋白与烟草、番茄等植物的MYC2蛋白具有较高的同源性;Sm MYC2蛋白无跨膜结构域、信号肽等结构。实时荧光定量PCR检测结果显示,Sm MYC2在丹参的根、茎、叶、花中均有表达,并且在根和茎中的表达量更高;此外,该基因表达受茉莉酸甲酯、光和机械损伤的诱导,但受赤霉素的抑制。本实验结果为进一步探讨Sm MYC2基因在丹参中的生物学功能奠定了基础。     

天麻素对脑缺血再灌注小鼠海马新生神经元的保护作用

目的:探讨不同剂量天麻素(Gastrodin,GAS)对缺血再灌注模型小鼠海马新生神经元的保护作用及其可能机制。方法:将50只C57BL/6小鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(MCAO+Vehicle)、模型+天麻素低剂量(10 mg/kg)组(MCAO+GAS(L)),模型+天麻素中剂量(50 mg/kg)组(MCAO+GAS(M)),模型+天麻素高剂量(100 mg/kg)组(MCAO+GAS(H))。除Sham组接受假手术外(皮肤切开,分离颈动脉),分别对MCAO组及MCAO+GAS各组行右侧颈内动脉栓线术,造成并保持大脑中动脉闭塞(MCAO)1 h。术后,Sham组和MCAO组即刻腹腔注射生理盐水(0.1 m L/kg),MCAO+GAS各组注射不同剂量天麻素,每24小时重复给药1次,连续7天。最后一次注射24 h后,对各组小鼠的神经功能进行评分,之后处死动物取脑组织,通过HE、免疫荧光染色以及Western Blot观察和比较各组小鼠海马形态学和DCX的表达水平。结果:(1)术后第7天,MCAO+Vehicle组小鼠神经功能评分(3.2±0.63)显著高于假手术组、MCAO+GAS(M)(1.8±0.63)和MCAO+GAS(H)组(P0.05)。(2)术后第7天,与假手术组相比较,MCAO+vehicle组海马颗粒细胞排列不规则,核稍大且固缩深染,齿状回部有较多空洞;与MCAO+vehicle组比较,MCAO+GAS(H)组海马空洞样改变减少,细胞排列较整齐,胞膜较完整,核结构较清晰。(3)术后第7天,与假手术组相比较,DCX染色阳性细胞数显著减少,而MCAO+GAS(M)组DCX染色阳性细胞数(183±64.5)和MCAO+GAS(H)组DCX染色阳性细胞数(195±93.68)显著高于MCAO+Vehicle组。MCAO+Vehicle组海马的DCX表达水平显著低于假手术组及MCAO+GAS(M)组和GAS(H)组(P0.01)。结论:天麻素可能通过上调海马DCX的表达水平,调节海马神经发生,进而对缺血性脑卒中后再灌注发挥神经保护作用。