鸭梨多酚氧化酶基因反义表达载体的构建及农杆菌介导的遗传转化

根据鸭梨多酚氧化酶基因序列设计引物,PCR扩增该基因3′端450bp的片段,并将该片段反向插入真核表达载体pB I121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,首次构建了鸭梨PPO基因的反义表达载体;其后,在农杆菌EHA105的介导下,成功实现了PPO反义基因对鸭梨组培苗的遗传转化。经Northern杂交和酶活检测证实,转基因鸭梨植株体内的多酚氧化酶基因转录和翻译水平均得到明显抑制,从而为耐褐化梨新品种的培育奠定了基础。     

鸭梨PPO与GFP融合基因的烟草转化及亚细胞定位观察

将鸭梨PPO基因与绿色萤光蛋白GFP基因相融合共同进行遗传转化的方式,对鸭梨多酚氧化酶开展细胞定位研究。通过克隆该酶基因除终止密码子TAA外长度为1 779bp的CDS序列,与绿色荧光蛋白基因重组构建了荧光表达载体pBI121-PPO-GFP,借助农杆菌转化烟草,转基因烟草叶片细胞经激光扫描共聚焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光与叶绿体自发荧光相重合。结果表明鸭梨多酚氧化酶为叶绿体蛋白质。     

‘鸭梨’果心多酚氧化酶提取方法的优化

以‘鸭梨’为供试材料,通过设定不同实验条件,分析影响果心多酚氧化酶（polyphenoloxidase,PPO）提取效率的部分因素,以期找到提取‘鸭梨’果心多酚氧化酶的最适条件。结果表明：磷酸盐提取缓冲液的pH≥7．0,提取缓冲液中分别含有0．2％TritonX-100、1％SDS、6％-8％PVP、2％PVPP以及每克果心鲜样中加入2mg抗坏血酸时均能高效提取‘鸭梨’果心PP0。     

鸭梨PbHCT3基因的克隆及表达分析

羟基肉桂酰CoA:莽草酸/奎宁酸羟基肉桂酰转移酶(HCT)是植物绿原酸合成的关键酶之一.该研究以鸭梨为材料,采用同源基因克隆的方法,克隆出一个鸭梨的HCT基因,命名为PbHCT3.PbHCT3基因cDNA全长序列为1 731bp,基因编码序列长度为1 317bp,编码438个氨基酸,含有酰基转移酶的2个保守序列HHAAD和DFGWG及保守结构域MVVNVTVRES.实时荧光定量PCR分析表明:PbHCT3基因在幼果果皮、果肉、果心、幼叶及花蕾期花瓣中的表达量较高.随着鸭梨果实生长,果实中PbHCT3基因表达量逐渐降低.研究表明,PbHCT3基因与鸭梨幼嫩组织的生长发育有密切关系.     

鸭梨ACC氧化酶基因cDNA片段的克隆及农杆菌介导的反义遗传转化

研究根据ACC氧化酶基因的保守序列设计一对特异性引物。以鸭梨果实为试材,借助RT,PCR方法扩增得到一条长度为831bp的鸭梨ACC氧化酶基因eDNA片段,该片段编码276个氨基酸残基,与其它梨品种ACC氧化酶基因序列同源性均在94％以上。将此片段反向插入真核表达载体pBI121的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,构建了鸭梨ACC氧化酶基因的反义表达载体．并在农杆菌LBA4404的介导下实现对鸭梨组培苗的遗传转化。经PCR鉴定证实共有4株鸭梨组培苗中外源基因得到成功转化,Southern杂交显示在这4株转基因鸭梨中除有1株外源基因呈双拷贝外,其余3株中外源基因均以单拷贝形式存在。     

鸭梨ＡＣＣ 氧化酶基因ｃＤＮＡ 片段的克隆及农杆菌介导的反义遗传转化

研究根据ACC氧化酶基因的保守序列设计一对特异性引物,以鸭梨果实为试材,借助RT PCR方法扩增得到一条长度为831bp的鸭梨ACC氧化酶基因cDNA片段,该片段编码276个氨基酸残基,与其它梨品种ACC氧化酶基因序列同源性均在94%以上。将此片段反向插入真核表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,构建了鸭梨ACC氧化酶基因的反义表达载体,并在农杆菌LBA4404的介导下实现对鸭梨组培苗的遗传转化。经PCR鉴定证实共有4株鸭梨组培苗中外源基因得到成功转化,Southern杂交显示在这4株转基因鸭梨中除有1株外源基因呈双拷贝外,其余3株中外源基因均以单拷贝形式存在。