丙酮酸氧化酶在压力下的解离

本文通过测定丙酮酸氧化酶内源荧光谱和荧光偏振的变化研究了该酶在1—2200bar压力下的解离。研究结果表明,在压力作用下酶的辅基FAD不可逆地从酶分子上解离下来,并因此引起酶的失活;酶亚基在压力下的解离是可逆的,在5℃,pH7.6条件下,该酶的解离自由能⊿G°为29.89k cal/mol,解离标准体积变化⊿V°为-220ml/mol。脱辅基丙酮酸氧化酶的解离自由能为24.93k cal/mol,证明FAD对酶有稳定作用;⊿V°则为-153ml/mol,减少了近30％,表明FAD对亚基间的空间大小有很大贡献。经胰凝乳蛋白酶部分酶解所活化的酶的解离⊿G°和⊿V°均有所增加,底物丙酮酸亦有相同的影响。研究还表明,碱性pH条件能促进丙酮酸氧化酶的解离。在此研究中,我们也观察到了Weber和Ruan在乳酸脱氢酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶等研究中报道的"conformational drift"现象。     

解离增强镧系元素荧光免疫分析灵敏度的改进

为提高解离增强镧系荧光免疫分析(DELFIA)的灵敏度或信／噪比,进行了一些重要的方法学研究．观察到了对于不同的铕量,荧光响应和信／噪比都随着增强液体积而明显地变化．对于确定的铕量,存在一个最佳体积,且铕量越小,其最佳体积也越小．实验中选择最佳体积是重要的．研究了增强液制备技术,发展了微滴定板条有效的清洗和干燥方法,使本底荧光明显降低．     

流式细胞术的发展及在植物研究中的应用

流式细胞术是通过对液流中各种荧光标记的颗粒进行多参数快速高效的定性或定量测定的方法,在科学研究的多个领域发挥重要作用。然而,由于植物组织及细胞壁和次生代谢产物等细胞的特殊成分和结构,限制了其在植物研究领域的应用。本文在介绍流式细胞仪发展和组成分类的基础上,着重讨论了流式细胞术在植物领域的应用、研究进展及应用限制,进而展望该研究领域的发展趋势,为拓宽植物流式细胞术的潜在应用范围提供新的思考方向。     

果蝇唾腺染色体观察材料的制备

选择夜间气候为南风、多云、20～28℃的条件下,用香蕉培养基引诱、采集果蝇.室内或恒温箱中培养12 d,取野外果蝇三龄幼虫替代实验室长期饲养的果蝇幼虫,制作果蝇唾腺染色体.经剥离、解离、染色、压片,观察到比实验室饲养的果蝇染色体较大、个体更清楚的片子.     

含质粒复制起始区ori44的苏云金芽胞杆菌解离载体的构建

将苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离酶识别位点res分别插入克隆载体pRSET B和pUC19得到质粒pBMB1201和pBMB1202。这两个质粒分别经BamHI/HindⅢ和EcoRI/HindⅢ双酶切回收含res位点的小DNA片段,与穿梭载体pHT3101经EcoRI/HindⅢ双酶切后回收的含大肠杆菌复制起始区、氨苄青霉素抗性基因和红霉素抗性基因的3.3kb片段连接,获得重组质粒pBMB1203。封闭pBMB1203两res位点外的BamHI和EcoRI位点后,得到解离载体pBMB1204。将来源于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种YBT-1520的质粒复制起始区ori44片段插入pBMB1204的两res位点之间,得到解离穿梭载体pBMB1205。该解离载体插入壮观霉素抗性基因后电转化无晶体突变株,在辅助质粒所提供的解离酶作用下可发生解离消除抗性基因,解离频率为100%,解离后的质粒稳定性为93%。利用解离穿梭载体pBMB1205可在用抗性筛选到转化子后特定消除抗性标记基因和其它非苏云金芽胞杆菌DNA片段。     

利用苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430构建含cry1Ac10基因的解离载体

将cry1Ac10基因和苏云金芽胞杆菌的复制起始区连 接在一起,并在其两侧按相同方向各连接一个来自苏云金芽胞杆菌转座子Tn4430的解离位点,构成转移单位。再将革兰氏阳性细菌的抗性标记基因和大肠杆菌克隆载体pUC19与之连接,获得含cry1Ac10基因的解离载体pBMB801。将其转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变体,再导入含解离酶基因的辅助质粒pBMB1200。在解离酶作用下,两个解离位点间发生重组,消除基在操作中的抗性标记基因等非必需基因片段,获得仅保留有完整cry1Ac10基因和来 自苏云金芽胞杆菌质粒复制起始区,在无抗生素选择压力下能稳定遗传的重组质粒pBMB801B 。     

嗜热酯酶APE1547催化活性的定向进化研究

对来源于嗜热古菌Aeropyrum pernix的酯酶(APE1547)催化活性进行定向进化研究。利用APE1547特殊的稳定性,建立了准确的高通量高温酯酶筛选方法。对第一代随机突变库筛选获得了催化活性较野生型提高1.5倍的突变体M010,序列分析表明其氨基酸突变为R526S。从第二代突变库中筛选出的总活力提高5.8倍突变体M020,突变位点为R526S/E88G/A200T/I519L,其比活力与M010一致,但表达量比野生型提高约4倍。对M020酶学性质表征发现,其最适pH为8.5,比野生型向碱性偏移0.5;活性中心残基酸性基团的解离常数(pK1)由野生型的7.0提高至7.5。晶体结构分析表明,突变位点R526距离活性中心较近,将其突变为Ser降低了活性中心的极性,抑制了催化残基His的解离,使酸性基团的解离常数升高。     

pH和温度对固氮酶还原基质的影响

确定了在pH 5.2到8.7和温度22°到45℃时钼铁蛋白和铁蛋白的稳定性。按logKm和logV分别对pH作图,得到下列参数。于30℃在酸性侧,乙炔络合常数PK_b(C_2H_2)=6.43—6.50,乙炔催化常数pK_b′(C_2H_2)=4.78,在碱性侧乙炔络合常数pK_a(C_2H_2)=7.42—7.55,乙炔催化常数pK_a′(C_2H_2)=7.88—8.29,氮络合常数pK_a(N_2)=7.75—7.9及氮催化常数pK_a′(N_2)=8.08—8.68。既然pK_a与pK_b或pK_a′与pK_b′二者间隔小于3.5个单位,又按V/Km及V′对pH作图,其结果为pKb(C_2H_2)=6.28pK_a(C_2H_2)=7.68和pK_b′(C_2H_2)=5.53和pK_a′(C_2H_2)=8.93。将不同温度下的pK_b或pK_a分别对各自温度的倒数作图,其热力学数据为由pH 5.7到7.3范围内,质子移变基团的解离热⊿H(ioh)=7742卡/克分子,相应的pK_b(C_2H_2)=6.16—6.36;由pH 7.3到8.4范围内⊿H_(ion)=6983卡/克分子,相应的pK_a=8.24—8.44。这些数据指出固氮酶钼铁蛋白络合乙炔的功能基团可能具有咪唑基·巯基和氨基相类似的结构,这种推测正在用化学修饰的方法加以验证。     

网状纤维染色中银氨离子的解离规律

目的 阐明网状纤维染色中银氨离子[Ag(NH3)2+]在蒸馏水中的解离规律,提高网状纤维染色的稳定性及一致性.方法 收集江门市中心医院病理科10例肝脏手术切除石蜡标本,采用改良Gordon-Sweets法进行染色,银氨液反应后置于蒸馏水中浸洗不同的时间以获得最佳的解离点,并在中山大学肿瘤防治中心146例肝癌病例中进行验...     

肌球蛋白微丝在高压力下的解离和重组

高压力下肌球蛋白微丝的解离研究表明,在１－６５０ｂａｒ压力下肌球蛋白微丝的解离是完全可逆的,在５℃时其解离平衡常数的对数ｌｇＫ＝－１２９,解离标准体积变化为２０８８ｍｌ／ｍｏｌ。研究还指出,由肌球蛋白聚合成肌球蛋白微丝的熵是＋１４８．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ（２０℃）,表明这是一熵驱动的自发过程,连续二次加压解离动力学研究结果暗示,肌球蛋白二体是肌球蛋白微丝解离过程中的中间体。