不同底物与固氮酶及其钼铁蛋白相互作用的荧光光谱分析

 本文研究了不同底物(N_2,H_2,N_2O,NaN_3,C_2H_2)对棕色固氮菌固氮酶及其钼铁蛋白荧光光谱的影响。结果表明,上述底物均能络合在钼铁蛋白及固氮酶上,但络合程度不同,从而为固氮酶系统有多个不同的底物络合中心,底物络合中心在钼铁蛋白分子上,铁蛋白对钼铁蛋白有变构作用,提供了光谱学证据。     

ATP功能及固氮酶催化机理

一、引言固氮酶能够催化N_2及其它底物(N~-_3、N_2O,C_2H_2,HCN,RCN,RNC,H~ ,丙二烯、环丙烯)的还原反应,ATP水解反应以及Na_2S_2O_4氧化反应。固氮酶究竟是钼铁蛋白,还是由钼铁蛋白     

固氮酶钼铁蛋白铁钼辅因子的抽提研究进展

固氮酶由两种铁硫蛋白(钼铁蛋白和铁蛋白)组成。由还原剂提供电子经铁(Fe)蛋白传递给钼铁(MoFe)蛋白,在MoFe蛋白的活性中心部位进行N_2、C_2H_2等多种底物的还原[10,11,20]。MoFe蛋白中的Mo、Fe原子和酸不稳定性硫原子(S~*)组成2个M簇(FeM-oco)、3—4个P簇(P-cluster)及1—2个S(2Fe)簇。在底物还原过程中,这些原子簇都可能参与电子的传递。铁钼辅因子(FeMoco)已被认为是络合和还原底物的重要部位。因此,要阐明MoFe蛋白的作用机理就得研究FeMoco的结构和功     

Na_2MoO_4-KBH_4系统模拟固氮酶催化反应的研究

本文报导了以Na_2MoO_4-KBH_4系统模拟固氮酶催化反应的研究工作。钼酸钠是一种最简单的钼的无机化合物。在硼氢化钾存在的情况下,钼酸钠就能催化乙炔还原为乙烯的反应。以反应初速度计,其比活达4.1mole C_2H_4/分·mole Mo,约为固氮酶活性的1%。米氏常数为0.77大气压、2.78×10~(-2)M。表观活化能为6.5千卡/克分子。处于活性状态的钼不是单核的,而可能是双核的。虽然乙炔还原的产物除乙烯外还有乙烷生成,但乙烯不能作为反应底物被还原。乙炔还原为乙烯和乙炔还原为乙烷的反应二者不相关。它们是由不同的活性钼络合物所催化。以20种不同的可作为钼的配位体的有机化合物对Na_2MoO_4-KBH_4系统乙炔还原催化反应的影响在相同条件下进行比较,可以看到一些有趣的规律。α、α′-二巯基己二酸-Na_2MoO_4-KBH_4系统的催化活性最高。二巯基乙烷-Na_2MoO_4-KBH_4系统只表现催化乙炔还原为乙烯的活性,反应产物中只有乙烯而没有乙烷或其他产物生成。象固氮酶一样,Na_MoO_4-KBH_4系统还具有催化乙腈还原的活性。在相同条件下用钨代替钼,无论Na_2WO_4-KBH_4系统还是半胱氨酸-Na_2MoO_4-KBH_4系统部不表现催化乙炔还原为乙烯的活性。解释了含钨的固氮酶无反应潘性的原因。同时还解释了在含钨的同氮酶及其他含钨的“钼”酶中钨不能与相应的蛋白有效地结合这一现象。本文还就Na_2MoO_4-KBH_4同氮酶模型系统的作用,反应规律,以及配位体和不同配位基团的作用等进行了讨论,并对当前通过模型系统来研究固氮酶的结构与功能的工作中的一些问题提出了作者的看法。     

Na_2MoO_4KBH_4系统模拟固氮酶催化反应的研究

本文报导了以Na_2MoO_4-KBH_4系统模拟固氮酶催化反应的研究工作。钼酸钠是一种最简单的钼的无机化合物。在硼氢化钾存在的情况下,钼酸钠就能催化乙炔还原为乙烯的反应。以反应初速度计,其比活达4.1moleC_2H_4/分·mole Mo,约为固氮酶活性的1%。米氏常数为0.77大气压、2.78×10~(-2)M。表观活化能为6.5千卡/克分子。处于活性状态的钼不是单核的,而可能是双核的。虽然乙炔还原的产物除乙烯外还有乙烷生成,但乙烯不能作为反应底物被还原。乙炔还原为乙烯和乙炔还原为乙烷的反应二者不相关。它们是由不同的活性钼络合物所催化。以20种不同的可作为钼的配位体的有机化合物对Na_2MoO_4-KBH_4系统乙炔还原催化反应的影响在相同条件下进行比较,可以看到一些有趣的规律。α、α′-二巯基己二酸-Na_2MoO_4-KBH_4系统的催化活性最高。二巯基乙烷-Na_2MoO_4-KBH_4系统只表现催化乙炔还原为乙烯的活性,反应产物中只有乙烯而没有乙烷或其他产物生成。象固氮酶一样,Na_2MoO_4-KBH_4系统还具有催化乙腈还原的活性。在相同条件下用钨代替钼,无论Na_2WO_4-KBH_4系统还是半胱氨酸-Na_2MoO_4-KBH_4系统都不表现催化乙炔还原为乙烯的活性。解释了含钨的固氮酶无反应活性的原因。同时还解释了在含钨的固氮酶及其他含钨的“钼”酶中钨不能与相应的蛋白有效地结合这一现象。本文还就Na_2MoO_4-KBH_4固氮酶模型系统的作用,反应规律,以及配位体和不同配位基团的作用等进行了讨论,并对当前通过模型系统来研究固氮酶的结构与功能的工作中的一些问题提出了作者的看法。     

钼铁蛋白铁钼辅因子的有机组分对其功能的影响

棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)固氮酶的钼铁蛋白经邻菲啰啉在厌氧或有氧环境中处理后,变为 P-cluster 单一缺失或 P-cluster 和 FeMoco 同时缺失的失活钼铁蛋白。含柠檬酸盐或高柠檬酸盐的重组液都使这两种失活蛋白能恢复固氮酶重组的 H~ 和 C_2H_2还原活性,活性恢复程度随反映钼铁蛋白中金属原子簇含量变化的圆二色和磁圆二色谱及金属含量的恢复程度的提高而提高,但它们固 N_2能力的恢复程度则不相同:P-cluster 单一缺失的蛋白用两种重组液重组后均可恢复其固 N_2能力,而 P-cluster 和 FeMoco 同时缺失的蛋白,只有用含高柠檬酸盐的重组液重组才恢复其固 N_2能力,表明含不同有机组分的重组液所组装的 P-cluster 均与天然状态相同,只有含高柠檬酸盐的重组液所组装的 FeMoco 才与天然状态相同,从而证明高柠檬酸盐是 FeMoco 的必需的有机组分。     

嗜热酯酶APE1547催化活性的定向进化研究

对来源于嗜热古菌Aeropyrum pernix的酯酶(APE1547)催化活性进行定向进化研究。利用APE1547特殊的稳定性,建立了准确的高通量高温酯酶筛选方法。对第一代随机突变库筛选获得了催化活性较野生型提高1.5倍的突变体M010,序列分析表明其氨基酸突变为R526S。从第二代突变库中筛选出的总活力提高5.8倍突变体M020,突变位点为R526S/E88G/A200T/I519L,其比活力与M010一致,但表达量比野生型提高约4倍。对M020酶学性质表征发现,其最适pH为8.5,比野生型向碱性偏移0.5;活性中心残基酸性基团的解离常数(pK1)由野生型的7.0提高至7.5。晶体结构分析表明,突变位点R526距离活性中心较近,将其突变为Ser降低了活性中心的极性,抑制了催化残基His的解离,使酸性基团的解离常数升高。     

N_2和NH_4~ 培养下粪产碱菌固氮酶铁蛋白的生物合成及特性比较

应用DEAE-纤维素和凝胶柱层析,分别将N_2和NU_1~ (30 mmol/L)培养的粪产碱菌固氮酶铁蛋白(Af2和Af~ 2)分离并提纯52倍,在SDS-PAGE上呈均一状态。Af2的比活性达1540 nmol C_2H_4mg~(-1)protein min~(-1),Af~*2无活性。Af2和Af~*2理化性质基本相同,分子量为64.5 kD;均由2个亚基组成,每个亚基分子量为32.5kD;氨基酸种类相同,总残基数分别为537和553,不含色氨酸;每分子Af2和Af~ 2均含有4个Fe原子和4个酸不稳定S~(2-)原子;UV-vis光谱吸收特征相同;荧光探剂测定结果为:每分于Af2和Af~*2均络合2个分子MgATP或2个分子MgADP。     

颗粒状固定化青霉素酰化酶的研究

将巨大芽孢杆菌 (Bacillusmegaterium)胞外青霉素酰化酶通过共价键结合到聚合物载体EupergitC颗粒环氧基团上 ,制成的颗粒状固定化青霉素酰化酶表现活力达 1 40 0 μ/g左右。固定化酶水解青霉素的最适 pH8 0 ,最适温度为 55℃。在pH6 0～ 8 5、温度低于 40℃时固定化酶活力稳定。在 pH8 0、温度 37℃时 ,固定化酶对青霉素的表现米氏常数Ka为 2×1 0 - 2 mol/L ;苯乙酸为竞争性抑制剂 ,抑制常数Kip为 2 8× 1 0 - 2 mol/L ;6 APA为非竞争性抑制剂 ,抑制常数Kia为 0 1 2 5mol/L。固定化酶水解青霉素 ,投料浓度为 8% ,在使用 2 0 0批后 ,保留活力 80 %左右 ,6 APA收率平均达 89 48%。     

氮磷添加对杉木林土壤碳氮矿化速率及酶动力学特征的影响

以江西杉木林红壤为研究对象,开展野外长期氮(N)、磷(P)添加控制试验,设置对照(CK)、N(50kg N hm~(-2)a~(-1))、P(50kg P hm~(-2)a~(-1))、NP(50kg N hm~(-2)a~(-1)+50kg P hm~(-2)a~(-1))处理,分析N、P添加对土壤碳矿化速率(C_(min))、氮矿化速率(N_(min))和相关的β-1,4-葡萄糖苷酶(βG)和β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(NAG)动力学参数的影响。结果表明:(1)N添加明显降低了C_(min)和N_(min),比CK分别减少了25%和18%;N添加减小了NAG的潜在最大酶活性(V_(max))、半饱和常数(K_m)、催化效率(V_(max)/K_m),但差异不显著(P0.05);N添加显著增加了βG的V_(max)、K_m,但对V_(max)/K_m有抑制作用。(2)P输入(P、NP)较CK使NAG的V_(max)、K_m减小26%—60%;NP同时添加明显提高βG和NAG的V_(max)/K_m(P0.05),但P输入(P、NP)对C_(min)和N_(min)影响不显著(P0.05)。(3)C_(min)与土壤溶解性有机碳正相关,N_(min)与pH显著正相关,与土壤NH_4~+-N、NO_3~--N显著负相关;βG和NAG的V_(max)/K_m均与NH_4~+-N、NO_3~--N负相关(P0.05),K_m均与NH_4~+-N、NO_3~--N正相关(P0.05)。βG的V_(max)与NH_4~+-N、NO_3~--N正相关(P0.05),NAG的V_(max)与有机碳、全氮、全磷、有效磷负相关(P0.05)。研究结果表明,在亚热带杉木人工林中,N添加降低土壤pH,增加土壤有效氮含量,抑制βG和NAG的V_(max)/K_m,对土壤C_(min)和N_(min)产生抑制作用;而NP添加增加土壤有效磷含量,增加土壤βG和NAG的V_(max)/K_m。