短间隔连续部分肝切除(SISPH)中ADAMs基因表达差异分析

用ADAMs通用引物进行RT PCR ,以检测短间隔连续部分肝切除 ( 4 3 6 3 6 3 6SPH)中不同恢复时间ADAMs基因转录情况。结果表明 :( 1)ADAMs基因转录无个体和性别差异 ,也无肝再生恢复期依赖性 ;( 2 )PCR产物克隆、测序证实 ,肝脏中有MDC9同源序列存在 ;( 3 )用MDC9特异性引物PCR检测表明 ,MDC9在正常和不同恢复时期肝脏中均有一定水平转录 ,说明MDC9在肝脏正常生理活动和肝再生中起重要作用     

全长cDNA克隆的三种方法的比较研究

为了得到一段EST所在基因的全长,采用了快速扩增cDNA末端（RACE）、cDNA文库构建、λphage测序引物与特异性引物结合,非放射性探针进行噬菌体原位杂交等方法分别对该基因进行了克隆,结果得到了一致的全长cDNA,三种不同实验方法的应用,为更方便、有选择性地克隆全长cDNA基因奠定了基础。     

pIRES2-GDNF-NT-3真核表达载体的构建与鉴定(英文)

目的:采用一种简便和高效的方法构建双基因共表达载体pIRES2-GDNF-NT-3。方法:人胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素3是采用PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取,将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-GDNF-EGFP.神经营养素3 cDNA片段通过替换EGFP的方式插入到pIRES2-GDNF-EGFP中构建成为pIRES2-GDNF-NT-3双基因共表达载体。结果:人胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素3被克隆,通过测序和酶切鉴定的得知与基因库报道序列一致。结论:人神经生长因子和神经营养素3双基因真核表达载体成功构建,它提供了一个新的表达系统,为进一步研究双基因的功能奠定了基础。     

大鼠短间隔连续部分肝切除上调表达基因的克隆与分析 *

以短间隔连续部分肝切除112h为试验方,以0h对照为驱动方,应用抑制性消减杂交技术构建了高效率的正向消减cDNA文库,从中随机挑取的50个克隆中有45个包含了100～350bp插入片段,对这些片段进行测序后经GenBank blast同源性检索,表明8个片段均为未知新序列。大鼠短间隔连续部分肝切除后肝再生cDNA正向消减文库的建立和未知的上调表达基因片段的克隆为研究肝再生的分子机理奠定了基础。     

pIRES2-NGF-NT-3真核表达载体的构建与鉴定

构建双基因共表达载体pIRES2-NGF-NT-3并检测其在HEK293细胞中的表达。人神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和神经营养素3(neurotrophin-3,NT-3)是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取,将人神经生长因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-NGF-EGFP。神经营养素3 cDNA片段通过替换绿色荧光蛋白基因(EGFP)的方式插入到pIRES2-NGFEGFP中构建成为pIRES2-NGF-NT-3双基因共表达载体,将pIRES2-NGF-NT-3用脂质体转染HEK293细胞并采用RT-PCR与Western-blot的方法检测其表达。人神经生长因子和神经营养素3被克隆,通过测序和酶切鉴定的得知与基因库报道序列一致。pIRES2-NGF-NT-3转染HEK293细胞后双基因在mRNA和蛋白水平均得到了表达。人神经生长因子和神经营养素3双基因真核表达载体成功构建,它提供了一个新的表达系统,为进一步研究双基因的功能奠定了基础。     

pIRES2-GDNF-NT-3真核表达载体的构建与鉴定

目的：采用一种简便和高效的方法构建双基因共表达载体pIRES2-GDNF-NT-3。方法：人胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素3是采用PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取,将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-GDNF-EGFP．神经营养素3cDNA片段通过替换EGFP的方式插入到pIRES2-GDNF-EGFP中构建成为pIRES2-GDNF-NT-3双基因共表达栽体。结果：人胶质细胞源性神经营养因子和神经营养素3被克隆,通过测序和酶切鉴定的得知与基因库报道序列一致。结论：人神经生长因子和神经营养素3双基因真核表达载体成功构建,它提供了一个新的表达系统,为进一步研究双基因的功能奠定了基础。     

CRISPR-Cas9系统在疾病模型中的应用

规律成簇间隔短回文重复（CRISPR）及相关核酸内切酶（Cas）系统是最近发现的一种关于RNA指导核酸内切酶的基因编辑技术,这一技术的发现促进了生物学和医学研究的发展。CRISPR-Cas9系统的简便性使其广泛应用于细胞基因组编辑、动物模型的构建及疾病模型的基因治疗。现就CRISPR-Cas9系统的结构特点、作用机制及应用进行了综述。     

C1型尼曼–匹克病小鼠雄性不育的睾丸病理研究

该文主要研究C1型尼曼–匹克病小鼠(Npc1~(–/–)小鼠)雄性不育的睾丸病理变化,并进一步探讨Npc1基因对雄性不育的影响。随机选取P60的Npc1~(–/–)和Npc1~(+/+)雄鼠各12只,观察隐睾发生率;然后,随机选取P20、P40和P60的Npc1~(–/–)和Npc1~(+/+)雄鼠睾丸组织,统计睾丸重量并计算睾丸指数, HE染色观察生殖细胞层数并测量生精小管直径, PAS糖原染色观察生殖细胞周期并统计精母细胞在总细胞数中的相对百分比,油红O染色观察间质细胞的脂质存储;最后,随机选择P60的Npc1~(–/–)和Npc1~(+/+)雄鼠睾丸,通过TUNEL染色观察生殖细胞凋亡,并通过Western blot检测凋亡蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、p53、Bax和Bcl-2的表达水平。结果显示,与Npc1~(+/+)雄鼠相比, Npc1~(–/–)雄鼠均有隐睾发生,睾丸重量和睾丸指数均显著降低(P0.05, P0.001),生殖细胞层数不明显,生精小管管径显著减小(P0.001),生精周期不规律且精母细胞数量显著减少(P0.001),间质细胞的脂质存储显著减少(P0.001);生殖细胞凋亡大幅增加(P0.001), Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、p53、Bax表达量显著升高(P0.001),Bax/Bcl-2比率显著升高(P0.001)。该文结果提示, Npc1基因突变导致隐睾、睾丸结构异常、间质细胞脂质储存减少及生殖细胞凋亡,因此, Npc1基因可能成为研究男性不育的新靶点。     

不同培养代次对经血源子宫内膜干细胞生物学活性的影响

该研究明确了不同培养代次经血源子宫内膜干细胞(menstrual blood derived endometrial stem cells,MenSCs)的生物学活性差异,为深入研究MenSCs生物学特性及其潜在临床应用提供理论支持。该研究使用钙黄绿素AM(Calcein-AM)染色检测体外培养至第三代(passage 3,P3)、P9和P15代MenSCs的形态;β-半乳糖苷酶染色检测不同培养代次MenSCs的衰老程度;活性氧试剂盒检测不同培养代次MenSCs中活性氧的变化;随后利用MTT、流式细胞术及细胞活死染色在接触式共培养条件下检测P3、P9和P15代MenSCs对小鼠脾淋巴细胞活性、细胞周期、死亡情况以及脾脏淋巴细胞中CD3^+和CD19^+淋巴细胞比例的影响。结果表明,随着培养代次的增加MenSCs细胞面积显著增大,在培养至P15代时MenSCs开始出现大量丝状伪足。衰老程度及活性氧的含量也随培养代次的增加而显著升高;随后与MenSCs接触式共培养体显著增加了小鼠脾淋巴细胞的活性,降低淋巴细胞死亡率,且随培养代次的增加,MenSCs对促进淋巴细胞存活、降低死亡的能力显著降低;进一步细胞周期检测发现,MenSCs无刺激淋巴细胞增殖分裂活性,但可显著降低淋巴细胞死亡及碎片化,且培养代次的增加可显著降低MenSCs维持淋巴细胞存活的能力;此外,不同培养代次MenSCs在体外均对小鼠脾淋巴细胞中CD3^+和CD19^+细胞亚群百分比无显著性影响。综上,MenSCs随着体外培养时间和代次的增加,出现明显的生物学活性降低等特征,且对淋巴细胞活性的调节能力显著降低,上述结果为临床应用中保障MenSCs质量、平衡细胞培养代次和细胞数量及保证稳定的MenSCs临床治疗效果提供理论支持。