杆状病毒部分功能基因的研究进展

杆状病毒以核型多角体病毒NPV的研究最为深入,到目前已有三种NPV的基因组全部测序：苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）［1］、黄杉古毒蛾核型多角体病毒（OpMNPV）［2］、家蚕核型多角体病毒（BmNPV）（GenBank accession no.L33180）。 　　杆状病毒基因组除编码病毒复制必需的基因及结构基因外,还编码一些有利于病毒充分增殖但对病毒复制并非一定必需的基因,这些基因在病毒的增殖过程中执行特定的功能,这类功能基因体现了杆状病毒的复制策略、病毒与细胞的相互作用关系,与杆状病毒宿主特异性的决定有关。本文综述了杆状病毒部分功能基因的研究进展。     

杆状病毒P10基因及P10蛋白

苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcMNPV)是多粒包埋型 NPV 的典型株。许多关于杆状病毒的分子生物学研究是以 AcMNPV 为代表的,因为它在昆虫细胞培养方面具有很多特点并且可以体外培养,家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是单粒包埋型 NPV 的代表,也具有同样的优点,更具有大规模人工培养的优势。AcMNPV 和 BmNPV 具有一个环状双链的 DNA 基因组,长约为128kb,可以编码一百种蛋白质。AcM-NPV 在感染细胞中大约有40种以上的特种蛋白已被报道。     

异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm ,明显小于野生型家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒     

棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒极早期基因(ie-1)分析(英文)

克隆了棉铃虫Helicoverpaarmigera单粒包埋型核型多角体病毒 (HaSNPV)C1株基因组DNA ,并通过随机测序的方法测定了经XbaI酶切后的H片段的核苷酸全序列。序列比较和分析发现该片段中ORF1 3与苜蓿丫纹夜蛾Autographacalifornica多粒包埋型核型多角体病毒 (AcMNPV)基因组ORF1 47(ie 1 )同源。ie 1基因编码区全长 1 986bp ,根据推测的氨基酸序列 ,可编码 6 6 1个氨基酸残基组成的多肽 ,预计分子量为 76 .5kD。将所推导的HaSNPVIE 1氨基酸序列与其它已知的杆状病毒IE 1氨基酸序列进行比较 ,结果表明 ,HaSNPV和谷实夜蛾H .zea单粒包埋型核型多角体病毒IE 1氨基酸序列最为相似 ,同源性高达 98%。与AcMNPV、家蚕Bombyxmori核型多角体病毒 (BmNPV)、云杉卷叶蛾Choristoneurafu miferana多粒包埋型核型多角体病毒 (CfMNPV)、舞毒蛾Lymantriadispar多粒包埋型核型多角体病毒(LdMNPV)、黄杉毒蛾Orgyiapseudotsugata多粒包埋型核型多角体病毒 (OpMNPV)、甜菜夜蛾Spodopteraex igua多粒包埋型核型多角体病毒 (SeMNPV)、小菜蛾Plutellaxylostella颗粒体病毒 (PxGV)和Xestiac ni grum颗粒体病毒 (XcGV)的IE 1氨基酸序列同源性较低 ,分别为 2 3 %、2 3 %、2 3 %、2 5 %、2 3 %、1 4%、2 7%和 7%。根据氨基酸序列由GENETYX     

杆状病毒凋亡抑制基因

杆状病毒(baculoviruses)感染昆虫细胞会引发细胞凋亡,然而病毒为了确保自身的复制和繁殖会抑制宿主细胞的凋亡.杆状病毒在长期进化过程中获得了凋亡抑制基因,如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica MNPV, AcMNPV)中的p35基因,棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsid nucleopolyhedrovirus, HaSNPV)基因组中的IAP基因家族,以及莲纹夜蛾核形多角体病毒(Spodoptera littoralis multicapsid nucleopolyhedrovirus, SpliMNPV)的p49基因等.尽管这些基因都具有抑制细胞凋亡的功能,但是作用途径和方式却各有差异.对杆状病毒3种抗凋亡基因的结构和功能作一简单的介绍和评述.     

苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒复制与宿主细胞核骨架关系初探

用选择性抽提方法和整装细胞电镜技术观察苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(AcMNPV)感染的Tn5B1细胞的核骨架结构体系,发现感染早期病毒的复制过程未对宿主细胞核骨架的形态结构产生明显影响,而感染晚期多角体的装配在核骨架网络中进行.以ie-1基因和多角体蛋白基因为探针,点杂交分析基因转录活性与宿主细胞核骨架的关系,结果表明在病毒感染早期,无论是正具转录活性的ie-1基因还是不具转录活性的多角体蛋白基因都可紧密结合在宿主细胞的核骨架上.     

一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统

将含有低拷贝数的mini Freplicon、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因 8.6kb的DNA片段经同源重组置换到棉铃虫核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因内 ,构建了既能在E .coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子棉铃虫核型多角体病毒Bacmid(HaBacmid HZ8)。另外将HaSNPV的多角体蛋白基因和P10启动子序列取代 pFastBacDual质粒上的AcMNPV的多角体启动子序列和P10启动子序列 ,构建插入HaSNPV多角体蛋白基因和P10启动子序列的HapFastBacPhP10供体质粒。利用HapFastBacPhP10供体质粒将eGFP基因转位至HZ8的Tn7附着位点上 ,随后将含有eGFP基因的重组HaBacmidDNA转染至HZAm1细胞内。转染 5d后 ,细胞核内能形成典型的多角体 ,在萤光显微镜下观察到细胞内显示出强烈的绿色萤光。结果证明我们构建的HaBactoBcac表达系统能有效的表达外源基因     

一种新颖的棉铃虫单闰包埋核多角体病毒表达系统

将含有低拷贝数的mini-F replicon,一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因8.6kb的DNA片段经同源重组置换到棉铃虫核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因内,构建了既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子棉铃虫核型多角体病毒Bacmid(HaBacmid-HZ8)。另外将HaSNPV的多角体蛋白基因和P10启动子序列取代pFastBacDual质粒上的AcMNPV的多角体启动子序列和P10启动子序列,构建插入HaSNPV多角体蛋白基因和P10启动子序列的HapFastBacPhP10供体质粒。利用HapFast BacPhP10供体质粒将eGFP基因转位至HZ8的Tn7附着位点上。随后将含有eGFP基因的重组HZAml细胞内。转染5d后,细胞核内能形成典型的多角体,在萤光显微镜下观察到细胞内显示出强烈的绿色萤光。结果证明我们构建的HaBac to Bcac表达系统能有效的表达外源基因。     

一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统

将含有低拷贝数的mini-F replicon、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因8.6kb的DNA片段经同源重组置换到棉铃虫核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因内,构建了既能在E.coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子棉铃虫核型多角体病毒Bacmid(HaBacmid-HZ8).另外将HaSNPV的多角体蛋白基因和P10启动子序列取代pFastBacDual质粒上的AcMNPV的多角体启动子序列和P10启动子序列,构建插入HaSNPV多角体蛋白基因和 P10启动子序列的HapFastBacPhP10供体质粒.利用HapFastBacPhP10供体质粒将eGFP基因转位至HZ8的Tn7附着位点上,随后将含有eGFP基因的重组HaBacmid DNA转染至HZAm1细胞内.转染5d后,细胞核内能形成典型的多角体,在萤光显微镜下观察到细胞内显示出强烈的绿色萤光.结果证明我们构建的HaBac to Bcac 表达系统能有效的表达外源基因.     

柞蚕核型多角体病毒载体在培养细胞和休眠蛹中的基因表达效果

柞蚕核型多角体病毒（AnpeNPV）作为基因表达载体在柞蚕培养细胞（AnPe细胞）和柞蚕蛹中已经成功地表达出了外来基因,并生产出了大量蛋白质。本文比较了AnpeNPV与苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcMNPV)、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和美国白蛾核型多角体病毒(HycuNPV)基因表达载体在培养细胞和昆虫活体组织内的β-半乳糖苷酶基因表达效果。结果显示,5×105个细胞中β-半乳糖苷酶的最高酶活性分别是AnpeNPV在AnPe细胞为40.9 units/ml （TC-100培养液,FBS10%）和59.9 units/ml（SF-900Ⅱ培养液）,AcMNPV在Sf9细胞为72.4 units/ml（TC-100,FBS10%）和66.4 units/ml（SF-900Ⅱ）、在High5细胞为326 units/ml（EX-CELL 405培养液）,BmNPV在Bm4细胞为15.1 units/ml（TC-100,FBS10%）,HycuNPV在SpIm细胞为68.6 units/ml（SF-900Ⅱ）。活体组织内β-半乳糖苷酶的最高酶活性分别是柞蚕雌蛹为14.3 units/g、雄蛹为11.7 units/g,家蚕幼虫是10.1 units/g。实验证明AnpeNPV/AnPe的外来基因表达水平与AcMNPV/ Sf9和HycuNPV/SpIm相似、比BmNPV/ Bm4高、不及AcMNPV/ High5;AnpeNPV/柞蚕蛹,其雌蛹比BmNPV/家蚕5龄幼虫的外来基因表达效果好、雄蛹与之无明显差异,说明AnpeNPV基因表达载体无论是在培养细胞还是昆虫活体组织中均可与其他NPV基因表达载体相媲美。柞蚕蛹由于可以机械化、大规模地操作,显示对于大量生产蛋白质具有更好的应用前景。     

家蚕核型多角体病毒的PCR检测及其部分序列分析

为研究应用PCR技术进行家蚕核型多角体病毒广东株的敏感性检验以及探讨不同地理株系的基因水平的相互关系,本文通过对家蚕核型多角体病毒BmNPV广东株的人工繁殖与纯化,引用了一对根据多角体蛋白基因设计的引物phy35/phy36,对BmNPV的基因组模板DNA进行了PCR扩增,并对其产物进行测序分析.结果显示,PCR技术均可扩增检测出3×108个/mL至3×102个/mL不同浓度的BmNPV模板DNA,特异目标片段大小约为680 bp,且扩增带的亮度随着病毒液浓度的降低而减弱,说明应用引物phy35/phy36进行PCR方法可以有效地应用于检测BmNPV病毒感染的家蚕.同时,测序获得了BmNPV广东株多角体蛋白polyhedrin基因674 bp大小的片段,GC含量为46.4%.经过BLAST比对分析,与BmNPV泰国株的相似性为99%,暗示家蚕BmNPV广东株与泰国株的BmNPV (登录号AY779044)亲缘关系非常相近,两者可能属于BmNPV的不同地理株系.通过系统发育树的进一步分析发现,家蚕核型多角体病毒广东株polyhedrin基因部分序列与家蚕NPV分离株S9多角体蛋白基因(DQ231336)关系很近.     

与宿主昆虫液化相关的杆状病毒基因及其蛋白

昆虫被杆状病毒感染后会发生液化现象,这有利于病毒向周围环境扩散。目前在杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒NPV和GV中,发现与昆虫宿主液化相关的基因有组织蛋白酶基因V-cath基因和几丁质酶基因。V-cath基因表达产物在苜蓿银纹夜蛾多角体病毒(AcMNPV)中能特异性降解昆虫细胞内的肌动蛋白。几丁质酶不仅参与了虫体体表面几丁质的降解,同时还参与V-CATH蛋白前体的加工过程,起分子伴侣的作用。对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的研究表明其FP25K基因表达产物通过影响组织蛋白酶的释放与分泌而参与虫体液化。简要综述了此3种基因及其表达产物的结构、功能与特性,并讨论了它们在生产上的应用前景。     

家蚕ADP/ATP转运酶(BmANT)抑制BmNPV增殖作用机制研究

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)隶属于杆状病毒,需要借助宿主细胞能量代谢进行自身增殖复制。家蚕ADP/ATP转运酶(Bombyx mori ADP/ATP translocase,BmANT)是线粒体转运蛋白,在BmNPV感染条件下和家蚕热休克蛋白60(heatshockprotein60,BmHSP60)具有直接的相互作用。因此,鉴定Bmant基因在BmNPV感染过程中的功能特征,有助于解析杆状病毒劫持宿主细胞因子促进自身增殖复制机制,完善杆状病毒和宿主相互作用网络。【方法】通过结构域预测BmANT蛋白的结构特征,荧光定量PCR分析Bmant基因在BmNPV感染后的变化特征;并过表达BmANT检测其对病毒DNA复制和病毒蛋白表达变化影响;进一步在转录水平分析Bmant和Bmhsp60基因的调控关系;最后通过流式细胞术等技术鉴定Bmant和Bmhsp60基因共同调控BmNPV增殖复制的机制。【结果】SMART软件预测显示BmANT包含3个线粒体载体结构域,BmNPV感染24 h后Bmant基因持续下调表达。过表达Bmant基因能够显著抑制BmNPV DNA的复制和VP39蛋白表达。荧光定量PCR分析显示Bmant和Bmhsp60基因具有相互拮抗作用,能够相互抑制转录。Bmant和Bmhsp60共同过表达分析显示,BmANT和BmHSP60共同作用BmNPV能够抑制病毒的增殖复制。【结论】结果表明,BmANT是一个线粒体载体蛋白,具有显著的抗病毒作用,能够下调Bmhsp60基因表达,并抑制BmNPV增殖复制。     

斜纹夜蛾spli caspase-1部分基因的克隆与分析

紫外线、芹菜夜蛾核型多角体病毒(sfMNPV)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)都可诱导斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)SL-1细胞凋亡,这说明在SL-1细胞中Caspase表达活性高,本实验从莲纹夜蛾(Spodoptera littoralis)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)序列出发,根据其中保守性高的序列设计引物,提取SL-1细胞中的总RNA,并进行逆转录和PCR扩增,获得了一条419bp的cDNA。     

棉铃虫核型多角体病毒几丁质酶基因及杆状病毒 几丁质酶基因的分子进化

用PCR方法扩增了棉铃虫Helicoverpa armigera单粒包埋型核型多角体病毒（HaSNPV）几丁质酶基因,测定了基因编码区的核苷酸全序列。基因编码区全长1.713 bp,可编码570个氨基酸残基组成的多肽,预计分子量为63.6 kD。将所推导的HaSNPV几丁质酶氨基酸序列与其它已知杆状病毒几丁质酶氨基酸序列进行联配比较,结果表明HaSNPV 与谷实夜蛾H.zea单粒包埋型核型多角体病毒（HzSNPV）的氨基酸序列非常相似,同源性高达90.7%,与苜蓿丫纹夜蛾Autographa californica多粒包埋型核型多角体病毒（AcMNPV）、家蚕Bombyx mori核型多角体病毒（BmNPV）、美国白蛾Hyphantria cunea核型多角体病毒（HcNPV）、舞毒蛾Lymantria dispar多粒包埋型核型多角体病毒（LdMNPV）、黄杉毒蛾Orgyia pseudotsugata多粒包埋型核型多角体病毒（OpMNPV）和云杉卷叶蛾Choristoneura fumiferana核型多角体病毒（CfMNPV）氨基酸序列同源性分别为64.4%、64.9%、64.2%、62.9%、66.2%和61.5%。根据氨基酸序列用PC＼GENE程序绘制已知杆状病毒几丁质酶的分子系统树,并与杆状病毒中最为保守的多角体蛋白基因系统树作了比较,结果表明几丁质酶基因和多角体蛋白基因的进化速率是不尽相同的。     

氯霉素乙酰基转移酶基因在家蚕核型多角体病毒P10基因启动子控制下的表达

昆虫核型多角体病毒(NPV)P10基因属于晚期基因,为强启动子所控制,又是病毒复制所非必需的基因。我们对前报的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)P10基因,应用PCR技术进行ATG区定点突变,在ATG被突变的同时形成一个BglⅡ酶切位点,得到一个不含ATG的BmNPV P10基因启动子。将长为230bp的经突变后的BmNPV P10基因5’端(包括启动子所有特征)片段克隆进pMMTV·CAT质粒中,构建成一个CAT基因在BmNPV P10基因启动子控制下的pBmPl0·CAT瞬间表达质粒。该质粒通过转染进入经野生型BmNPV感染的BmN细胞中,CAT得以表达。证明BmNPV P10启动子是比较强的启动子,可以在BmN细胞表达外源基因,具备了作为表达载体启动子的特性。     

甜菜夜蛾核多角体病毒在离体细胞中连续传代时重复DNA片段的产生和分析

野生型甜菜夜蛾核多角体病毒 (SeMNPV)US1分离株 (SeUS1 )通过空斑法纯化 ,PCR、长片段PCR和限制性内切酶分析筛选和鉴定 ,获得一株基因型较为均一且具完整基因组的克隆株 ,命名为Se 4。Se 4在其宿主细胞系Se3 0 1中无稀释连续传代至 1 0代 ,各代被感染细胞中的病毒DNA经限制性内切酶分析 ,发现在第 7代时病毒基因组中出现了一条新增的 3 .5kb片段 ,随着代数的增加 ,该片段的摩尔量逐渐增加 ,在第 1 0代时已成为超摩尔带 ,推测该片段为SeMNPVDNA复制的顺式作用元件。序列分析表明 ,该片段覆盖了SeMNPV 81 0 1 4～ 845 3 8nt共 3 5 2 5bp的序列 ,包含被预测为杆状病毒的DNA复制原点的non hr区域以及一些SeMNPV特有的ORF。研究结果为核多角体病毒II组的non hr在病毒复制过程中具有重要作用的观点提供了体外实验的证据     

家蚕胚胎细胞系Bm-Em-1的建立和特性研究

昆虫细胞系在病毒生物学、 基因功能的研究以及杆状病毒表达系统生产重组蛋白的应用中发挥着重要的作用。本研究由家蚕Bombyx mori “大造”品种反转期胚胎建立了一株细胞系Bm-Em-1, 在含10％胎牛血清的TNM-FH培养基中已传代40余代。显微观察表明, 细胞形态主要为圆形和短梭形, 细胞染色体呈短棒状和颗粒状, 数量多、 异倍化, 符合典型的鳞翅目昆虫细胞染色体特征。RAPD鉴定结果表明, 该细胞系来源于家蚕胚胎, 其扩增谱带与BTI-Tn5B1-4和Sf-9等细胞系明显不同。生长曲线测定结果表明, 第28代细胞的群体倍增时间为82.2 h。病毒敏感性测定显示, 该细胞系不能被苜蓿银纹夜蛾Autographa californica核型多角体病毒（AcMNPV）感染, 但对家蚕核型多角体病毒（BmNPV）高度敏感, 96 h的感染率为91.3％。结果说明该细胞系可作为家蚕病毒离体复制、 BmNPV表达系统以及家蚕基因功能研究的理想材料。     

棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(HaSNPV)Hind Ⅲ-L片段的序列分析

本文报道了棉铃虫单核衣壳核多角体病毒(Helicoverpa armigera single-nucleocapsid nucleopolyhedrovirus,HaSNPV)基因组的HindⅢ-L片段的全序列.该片段全长2 635bp,包括5个有意义的开放阅读框HaSNPV ORF227,晚期表达因子10基因(lef10),vp1054基因,Ac55(AcMNPV ORF55的同源基因),Ac56(AcMNPV ORF56的同源基因).与其它6种杆状病毒的氨基酸序列比较表明,HaSNPV的lef10基因与甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeMNPV)的同源性最高,为64%,与冷杉毒蛾核型多角体病毒(OpMNPV)的同源性最低,为43%;HaSNPV的vp1054基因与SeMNPV的同源性最高,为65%,与OpMNPV的同源性最低,为49%.序列比较表明,HaSNPV的LEF10与VP1054蛋白与其它6种杆状病毒具有相同的保守区和亮氨酸拉链(1eucine zipper)     

杆状病毒囊膜糖蛋白gp64基因启动子活性分析

GP64是杆状病毒在其发育循环第一时相所产生的芽生型病毒粒子（budded voirus,BV)的特异性囊膜糖蛋白。它在病毒入侵细胞过程中具有重要作用。为了探明杆状病毒gp64基因的表达调控。从所克隆的BmNPV和AcMNPVgp64基因ATG上游437-439bp启动子的序列分析发现。该启动子同时具有早期和晚期转录模体,将所构建的该启动子控制下荧光素酶报告基因（Luc)的非融合表达质粒分别转染Bm-N和Sf-21细胞进行瞬间表达分析,BmNPVgp64启动子能被允许宿主Bm-N细胞RNA聚合酶Ⅱ所识别,AcMNPVgp64启动子既能被允许宿主Sf-21又能被非允许宿主Bm-N细胞RNA聚合酶Ⅱ所识别,同时,这两个启动子的转录活性在各自的允许宿主细胞中被相应的病毒因子所反式激活2.4-4倍。将家吞核多角体病毒同源重复序列3（BmNPV homologous region-3,hr3)克隆到该启动子控制下的Luc报告基因下游,用所构建的质粒分别转染细胞,瞬间表达分析结果表达,BmNPVhr3能分别增强该启动子在Bm-N和Sf-21细胞中的转录活性13-22倍和7000-14000倍以上,同时,相应的病毒因子能反式激活插入了hr3的gp64启动子在各自允许宿主细胞中转录活性73-78倍,这暗示着BmNPVhr3除了具有病毒DNA复制原点和增强子的功能外,它在病毒的反式激活过程中起着重要的作用。