甘蔗己糖转运蛋白基因ShHXT6的亚细胞定位及表达

通过NCBI公布的同源物种设计特异性引物克隆出甘蔗己糖转运蛋白基因Sh HXT6。该基因c DNA长1 929 bp,其开放阅读框编码490个氨基酸。蛋白分子量为53.87 k D,理论等电点为9.44。该基因编码的氨基酸与玉米、狗尾草和水稻的己糖转运蛋白的一致性分别为80.85%、76.89%和72.86%等。系统进化树分析表明,Sh HXT6氨基酸与玉米HXT6蛋白一致性非常相近。Sh HXT6在未成熟组织中表达较高,尤其是未成熟叶,在根中几乎不表达。构建该基因的瞬时表达载体,通过农杆菌注射洋葱表皮的方法对Sh HXT6编码的蛋白进行亚细胞定位,结果表明,该基因编码的蛋白定位于细胞膜。     

青蒿琥酯对肺癌裸鼠新生血管生成的影响及机制相关研究

摘要 目的：探讨与研究青蒿琥酯对肺癌裸鼠新生血管生成的影响及机制。方法：27只裸小鼠随机平分为3组-肺癌组、青蒿琥酯1组与青蒿琥酯2组,每组9只。所有小鼠都给予腹腔注射肺癌A549细胞成瘤,致瘤成功后肺癌组、青蒿琥酯1组与青蒿琥酯2组组采用磷酸盐缓冲液、2.0 mg/mL与4.0 mg/mL的青蒿琥酯进行灌胃,1次/d,持续10 d。结果：所有小鼠都致瘤成功,青蒿琥酯1组、青蒿琥酯2组的移植瘤重量低于肺癌组(P<0.05),抑瘤率高于肺癌组(P<0.05),青蒿琥酯2组与青蒿琥酯1组对比差异有统计学意义(P<0.05)。青蒿琥酯2组、青蒿琥酯1组的移植瘤细胞凋亡指数高于肺癌组(P<0.05),青蒿琥酯2组高于青蒿琥酯1组(P<0.05)。青蒿琥酯2组、青蒿琥酯1组的移植瘤组织周围淋巴管密度低于肺癌组(P<0.05),青蒿琥酯2组低于青蒿琥酯1组(P<0.05)。青蒿琥酯2组、青蒿琥酯1组的血清肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α与白介素(Interleukin,IL)-6水平低于肺癌组(P<0.05),青蒿琥酯2组低于青蒿琥酯1组(P<0.05)。青蒿琥酯2组、青蒿琥酯1组的移植瘤结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白相对表达水平低于肺癌组(P<0.05),青蒿琥酯2组低于青蒿琥酯1组(P<0.05)。结论：青蒿琥酯在肺癌裸鼠的应用能抑制CTGF、VEGF蛋白表达,降低炎症因子的表达,促进肿瘤细胞凋亡,从而发挥抑制肿瘤增殖与新生血管生成的作用。     

杨树ERF11转录因子基因应答渗透胁迫表达分析

从小黑杨(Populus simonii×P.nigra)叶片中克隆出732 bp的ERF11转录因子基因(Potri.011G057000.1)cDNA,其编码的蛋白含有243个氨基酸,属于不稳定的亲水蛋白,不存在信号肽,不具跨膜能力,含AP2/ERF家族保守结构域。系统进化树表明,小黑杨ERF11蛋白与胡杨、麻疯树、蓖麻、橡胶树、木薯遗传距离较近,说明其亲缘关系较近。亚细胞定位结果表明,ERF11蛋白定位于细胞核中。ERF11基因表达具有组织特异性,并受胁迫诱导表达。其在根中相对表达水平明显比在茎和叶中表达水平高,在盐和甘露醇胁迫下,基因均表现上调表达。表明ERF11转录因子基因可能与植物应答高盐和干旱胁迫相关。     

青蒿琥酯联合头孢菌素类药物对多重耐药肺炎克雷伯菌抗菌活性的分析

为探讨青蒿琥酯(artesunate,ASN)单独或联合头孢菌素类药物对多重耐药(multidrug-resistant,MDR)肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的抗菌活性.本研究收集2018年长沙市中心医院临床分离的多重耐药肺炎克雷伯菌菌株32株.分为单独用药组:青蒿琥酯(ASN)组、头孢曲松钠(CRO)/头孢他啶(CAZ)组和联合应用组.采用细菌动态生长曲线法观察青蒿琥酯联合头孢菌素类药物对多重耐药肺炎克雷伯菌的生长影响;采用微量肉汤稀释法检测青蒿琥酯单独或联合头孢菌素类药物对多重耐药肺炎克雷伯菌的抗菌作用;采用RT-PCR技术检测外排泵基因AcrB mRNA以及其调控基因MarA和AcrR mRNA的表达水平.结果 显示,终浓度为2048μg/mL ASN联合头孢曲松钠、头孢他啶明显地抑制了多重耐药肺炎克雷伯菌的生长,曲线走向平缓;终浓度为1024μg/mL ASN联合头孢曲松钠、头孢他啶对多重耐药肺炎克雷伯菌的MIC50与单独用药组比较显著减低,均有统计学意义(K=68.07,P＜0.05;K=62.34,P＜O.05).1024 μg/mL ASN联合头孢曲松钠、头孢他啶均以相加作用为主;2048μg/mL青蒿琥酯和头孢曲松钠、头孢他啶联用时,可以抑制外排泵基因AcrB的表达,2048 μg/mL青蒿琥酯联合512 μg/mL头孢曲松钠明显抑制正向调控子MarA的表达,而对于负性调控子AcrR的表达没有明显影响.青蒿琥酯能显著改善多重耐药肺炎克雷伯菌对头孢曲松钠以及头孢他啶的敏感性,其机制可能与下调外排泵基因AcrB的表达有关.     

甜荞柠檬酸转运蛋白基因FeFRD3的克隆及表达分析

该研究采用同源克隆策略,从甜荞中克隆到1个柠檬酸转运蛋白基因FeFRD3(GenBank登录号为MG462907)。FeFRD3基因含一个1 554bp开放阅读框,编码517个氨基酸,预测蛋白分子量为55.83kD,等电点为8.48。生物信息学分析显示,FeFRD3蛋白含有8个跨膜区,定位于质膜和液泡膜上。蛋白序列分析结果表明,FeFRD3与拟南芥、大豆和水稻的FRD3同源蛋白有较高的序列一致性。系统进化树分析表明,FeFRD3属于具有将铁由根向地上部位长距离转运功能的柠檬酸转运蛋白,且与拟南芥AtFRD3亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明,FeFRD3基因在甜荞根、茎、叶和种子中均有表达,但在根中的表达量最高,在种子中的表达量最低;缺铁胁迫没有影响FeFRD3基因在根中的表达,但高铁胁迫明显诱导了该基因在根中的表达。研究结果为进一步深入研究FeFRD3基因在甜荞铁长距离转运中的功能奠定了基础。     

青蒿素模拟热量限制延长酵母寿命的双期响应模式全转录组谱解析

热量限制(CR)可延长酵母及哺乳动物等多种生物的寿命.尽管CR延寿被认为与呼吸活动增强有关,但营养摄取不足反而加大能量消耗显然不符合逻辑.在解决食物供应减少与代谢消耗增加这对矛盾的过程中,本研究揭示了1种基于CR的"双期响应"模式,它包括1个"线粒体增强期"(ME)与1个"后线粒体增强期"(PME),两者可依据线粒体标志蛋白的表达模式及活性动态加以区分.ME以整体抗氧化活化为特征,PME则以系统代谢调整为标志.抗疟药青蒿素的半合成衍生物青蒿琥酯通过烷化血红素蛋白可重现CR的衰老延缓效果,提示青蒿琥酯-血红素结合可以在功能上模拟一氧化氮-血红素相互作用,据此已建立青蒿琥酯-血红素结合物形成与细胞色素c氧化酶活性升高之间的相关性.外源过氧化氢也能模拟CR诱导抗氧化基因,改变代谢节律,延长酵母寿命,暗示过氧化氢与延寿有关.青蒿琥酯可模拟CR激发的一氧化氮及过氧化氢诱导的抗氧化反应,清除活性氧,降低氧化应激,指导机体由合成代谢向分解代谢转变,维持必要的代谢功能,延长酵母的期望寿命.     

青蒿琥酯抗蜡螟烟曲霉感染自噬机制初步研究

目的探究青蒿琥酯在蜡螟感染烟曲霉后,对蜡螟的自噬相关蛋白的表达影响。方法用一定量的烟曲霉的活化孢子感染蜡螟,经过1 h,用青蒿琥酯注射一组蜡螟,两性霉素B注射一组蜡螟,剩余的作为感染组。12 h后,取各组蜡螟进行病理切片染色,观察各组的病理情况;取各组的蜡螟的淋巴液,收集各组的孢子,用真菌活性检测试剂盒检测孢子活性并将淋巴细胞分离、裂解,离心取上清,用Western-blot法检测上清液中的Dectin-1、ROS、LC3Ⅱ的表达水平。结果青蒿琥酯注射组的蜡螟病理切片中的孢子比感染组数量少且聚集在一起,未长出菌丝,而体外分离的真菌孢子,青蒿琥酯组的活性明显受到抑制。经Western-blot显示青蒿琥酯能增强淋巴细胞Dectin-1、ROS、LC3Ⅱ的表达。结论青蒿琥酯可通过抑制烟曲霉的活性和增强蜡螟淋巴细胞的自噬水平,对抗蜡螟烟曲霉感染。     

青蒿琥酯和青蒿素抗肿瘤作用及其机制的初步研究

目的:探讨人白血病细胞株K562经青蒿琥酯和青蒿素处理后基因表达的变化及其可能机制.方法:K562细胞经不同浓度青蒿琥酯和青蒿素处理24h后,倒置相差显微镜和荧光显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞仪检测细胞周期变化;提取细胞总RNA,将逆转录生成的cDNA与基因芯片杂交,分析杂交结果.结果:倒置光显微镜:细胞出现不同程度的皱缩,核分裂相减少,细胞密度下降,漂浮细胞增多.荧光显微镜:染色质高度浓缩、边缘化,凝聚成明亮的团块,即凋亡小体.流式细胞仪:G2期细胞的比例明显增加.芯片杂交分析数据,青蒿琥酯处理组有10条基因表达有差异,表达上调的基因有:p21、chk1,表达下调的基因有:cyclinB1、cyclinE1、E2F1、DNA-PK、hTERT、bcl-2、jnk、VEGF;青蒿素处理组有10条基因表达下调:cyclinD1、cdk4、cdk2、cdc2、DNA-PK、DNA-TopoI、mcl-1、erk、jnk、VEGF.结论:青蒿琥酯和青蒿素可以抑制K562细胞增殖,作用机制与改变细胞周期某些调控物质的基因表达、诱导K562细胞凋亡等有关.     

青蒿琥酯治疗肺烟曲霉感染自噬机制

目的探究青蒿琥酯在鼠肺感染烟曲霉后,对鼠肺自噬相关蛋白的表达影响。方法用一定量的烟曲霉的活化孢子感染鼠肺,建立肺烟曲霉病模型。同时用青蒿琥酯注射一组鼠肺,两性霉素B注射一组鼠肺,剩余的作为感染组。24h后,取各组鼠肺进行病理切片染色,观察各组病理情况;取各组鼠肺的组织并匀浆,收集各组的孢子,用真菌活性检测试剂盒检测孢子活性并将肺巨噬细胞进行分离、裂解,离心取上清,用Western-blot法检测上清液中的Dectin-1、ROS、LC3Ⅱ的表达水平。结果青蒿琥酯注射组的鼠肺病理切片中的孢子比感染组数量少且聚集在一起,未长出菌丝,而体外分离的真菌孢子,青蒿琥酯组的活性明显受到抑制。经Western-blot显示青蒿琥酯具有增强肺巨噬细胞Dectin-1、ROS、LC3Ⅱ的表达。结论青蒿琥酯可通过抑制烟曲霉的活性和增强鼠肺巨噬细胞的自噬水平,对抗鼠肺烟曲霉感染。     

橡胶树DELLA蛋白编码基因HbGAI的克隆与表达分析

该研究采用RT-PCR与RACE技术,从橡胶树‘热研7-33-97’胶乳中克隆了1个DELLA蛋白编码基因HbGAI(GenBank登录号为KT696439)。HbGAI全长cDNA序列2 050bp,包含1个长1 842bp的完整开放阅读框。序列分析显示,HbGAI基因编码613个氨基酸,其推导的蛋白含有DELLA和GRAS结构域,分子量为66.476kD,理论等电点为5.19,无跨膜结构域,属于亲水性蛋白。进化树分析表明,HbGAI蛋白与其他植物中DELLA蛋白具有较高的相似性,与麻疯树JcGAI和蓖麻RcGAI亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示,割胶和茉莉酸甲酯处理下调胶乳中HbGAI基因的表达,乙烯利处理4h内显著上调胶乳中HbGAI基因的表达,表明HbGAI基因可能在橡胶树割胶、茉莉酸、乙烯响应中发挥作用。     

巴西橡胶树鲨烯合酶基因的克隆与序列分析

鲨烯合酶(SQS )是植物甾醇和三萜化合物生物合成途径中的关键酶。以巴西橡胶树为试验材料,提取胶乳总 RNA,利用 RT-PCR 以及 RACE 的方法克隆橡胶树鲨烯合酶 cDNA 编码区片段,并进行序列分析。结果表明：橡胶树鲨烯合酶 cDNA 编码区为1239 bp,编码413个氨基酸,命名为 HbSQS 。荧光定量分析表明鲨烯合酶基因在不同组织里表达水平存在明显差异,且受乙烯调控。     

天山雪莲未知蛋白基因的克隆及其耐铝特性分析

从天山雪莲叶片低温诱导的cDNA文库中克隆了一个未知蛋白基因(SikSD-82)cDNA全长序列。生物信息学分析表明SikSD-82基因共编码262个氨基酸,具有小麦铝诱导蛋白Wali7的保守结构域,属Gn_AT_Ⅱ家族的可溶性蛋白;其氨基酸序列与蓖麻的茎部特异性表达蛋白相似性最高为60.89%;进化树分析显示,该蛋白与番茄的茎部特异性表达蛋白关系最近。亚细胞定位结果表明,SikSD-82蛋白主要定位于细胞核。在铝胁迫条件下,转SikSD-82烟草幼苗根的伸长明显优于野生型,根部铝离子和丙二醛含量均显著低于野生型烟草,转SikSD-82烟草显示出较强的耐铝性。     

红纹黄单胞菌a-氨基酸酯水解酶的克隆、序列分析及热稳定性提高

【目的】克隆红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶基因全序列,对序列进行生物信息学分析,并提高酶的热稳定性。【方法】利用多聚酶链式反应(PCR)克隆α-氨基酸酯水解酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,预测红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的三维结构;通过定点突变替换氨基酸序列中高度柔性的位点,提高该酶的热稳定性。【结果】从红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrillineans)中扩增得到α-氨基酸酯水解酶基因aeh(GenBank登录号JF744990),核苷酸序列长度1 917 bp,编码638个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str.GPE PC73的肽酶及地毯草黄单胞菌Xanthomonas axono-podis pv. citri str. 306的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶氨基酸序列相似性最高,分别为91%和83%,系统进化分析表明,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str. GPEPC73的肽酶亲缘性最高。基于预测的三维模型,对高度柔性的位点进行饱和突变,从282株突变体中筛选得到3株T50较野生型高5°C以上的突变体。【结论】对红纹黄单胞菌AEH的氨基酸序列分析有助于探索同源蛋白的进化过程。对高度柔性位点进行饱和突变的策略可以用于提高热稳定性。     

巴西橡胶树HbCPP1基因的克隆与表达分析

CPP基因家族是广泛存在于动植物中,成员数目较少的一类转录因子家族,在植物生殖发育和细胞分裂过程中起着重要的调控作用。本研究以橡胶树优良品种‘热研7-33-97’为供试材料,通过RT-PCR方法,在橡胶树花器官中克隆到一个CPP基因,命名为Hb CPP1(登录号为MF360959)。序列分析表明,Hb CPP1基因开放阅读框为1 755 bp,编码584个氨基酸,蛋白质分子量为63.676 k Da,等电点(PI)为8.4。序列多重比对结果显示,HbCPP1蛋白具有CPP蛋白的特征基序,含有2个保守的CXC结构域和1个比较保守R结构域。进化树分析表明,Hb CPP1属于A亚族基因,与其近缘物种木薯的Me CPP基因以及麻风树的Jc CPP7基因同源性较高,进化关系较近。氨基酸组分、理化性质以及蛋白结构预测分析显示,Hb CPP1蛋白是一个不具有跨膜结构和信号肽的不稳定亲水蛋白,可能定位于细胞核,其二级结构主要由两个蛋白结合区域和多个无规则的卷曲螺旋组成,其三级结构中CRC结构域构成了该蛋白的核心结构。利用QRT-PCR对Hb CPP1基因在橡胶树不同组织中的表达量进行检测,分析结果表明Hb CPP1基因在橡胶树茎尖、花序以及雌花中特异性高调表达。在干旱、盐、高温胁迫以及ABA处理下,Hb CPP1基因的表达量呈显著下调表达;而在低温处理下,Hb CPP1基因的表达量则呈显著上调表达,推测Hb CPP1基因可能参与了橡胶树花器官发育以及对多种非生物学胁迫的响应过程。     

大豆再生相关基因GmBIN2的克隆及生物信息学分析

根据前期实验获得的大豆Gm BIN2基因登录号,从大豆中克隆Gm BIN2基因的全长CDS序列,得到大豆Gm BIN2基因。对大豆再生相关基因Gm BIN2的启动子序列、氨基酸序列、编码的蛋白质结构、亲疏水性以及同源进化树进行分析,结果表明,大豆再生相关基因Gm BIN2编码区c DNA长度为1 125 bp,编码374个氨基酸,Gm BIN2编码的蛋白为亲水性蛋白;分析其蛋白功能结构域发现,Gm BIN2蛋白具有丝氨酸/苏氨酸激酶催化域,为PKc-like超家族成员;构建系统进化树发现其与野生大豆亲缘较近。本研究的实验结果有利于更加深入的研究Gm BIN2基因在大豆再生过程中的关键作用,为提高大豆再生效率提供依据。     

拟南芥AAP基因家族的生物信息学分析

氨基酸通透酶(amino acid permease,AAP)是一种跨膜转运蛋白,广泛参与氨基酸的吸收、转运。本研究采用生物信息学方法对拟南芥AAP基因家族8个成员(编号AtAAP1~At AAP8)进行染色体定位、蛋白质理化性质、亚细胞定位、三级结构、跨膜区、基因结构及调控元件等进行分析,为探索AAP基因在拟南芥氨基酸吸收转运中的作用及进一步研究AtAAP基因家族的功能提供理论依据。     

大肠杆菌tyrR基因剔除及其对苯丙氨酸生物合成的影响

TyrR是大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成和运输途径中的一种全局性调控蛋白质。采用双交换同源重组的方法定位突变大肠杆菌染色体tyrR基因 ,在该基因中插入带有卡那霉素抗性基因的DNA片段 ,使之失活 ,实现基因剔除。经PCR、DNA测序、lacZ报告基因等多种方法证实了基因剔除的可靠性。tyrR基因剔除后 ,大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成中受TyrR蛋白调控的关键酶的酶活力有所提高 :3 脱氧 2 阿拉伯庚酮糖 7 磷酸合成酶(DAHPS ,由aroG编码 )酶活力提高了 1.0 8倍 ,转氨酶 (AT ,由tyrB编码 )酶活力提高了 2 .70倍 ;突变菌株发酵生产苯丙氨酸的能力提高了 1.5 9倍 ;同时 ,与芳香族氨基酸运输相关的通透酶基因aroP(P)的阻遏被解除 ,细胞运输芳香族氨基酸的能力提高了 70 .2 %。     

朵丽蝶兰二氢黄酮醇4-还原酶基因DtpsDFR的克隆与表达分析

二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reduetase,DFR)是花色素苷合成途径中的一个关键酶。该研究利用RT-PCR和RACE技术从朵丽蝶兰‘满天红’深红色花瓣中克隆获得一个DFR基因,命名为DtpsDFR。该cDNA序列全长1 286 bp,编码378个氨基酸。氨基酸序列分析表明,DtpsDFR编码的蛋白与Bromheadia fi nlaysoniana、文心兰、大花蕙兰、石斛兰等兰科植物的DFR蛋白同源性均在76%以上,含有1个FR_SDR_e特征结构域,存在NADPH结合基序和底物特异性结合基序,属于NADB_Rossmann超家族;系统进化树显示,DtpsDFR与Bromheadia fi nlaysoniana的DFR蛋白亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果显示,DtpsDFR基因的表达量随着花的发育逐渐降低,凋谢期微量表达;在花瓣、萼片中的表达量高于唇瓣,在叶片和根中微量表达。     

蜜蜂几丁质酶基因(Cht 5)的生物信息学分析

本研究采用生物信息学方法,对蜜蜂几丁质酶基因(Cht 5)编码蛋白的氨基酸组成、理化性质、疏水性、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、结构功能域以及空间的二级结构和三级结构等方面进行分析和预测,并构建了系统进化树。分析结果显示,蜜蜂几丁质酶基因(Cht 5)全长1 848 bp,编码537个氨基酸,属于亲水性蛋白,含有信号肽,有典型的跨膜螺旋区,二级结构主要由无规则卷曲构成。系统进化树分析结果与传统的生物学分类结果一致。实验结果可为进一步开展蜜蜂几丁质酶基因家族的功能研究和应用提供信息参考。     

巴西橡胶树两个蔗糖合成酶基因的克隆和表达分析

为了解蔗糖合成酶在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)生长和发育过程中的功能,利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆了蔗糖合成酶基因,并对基因的表达特征进行了分析。结果表明,从巴西橡胶树中克隆了两个蔗糖合成酶基因(HbSS1和HbSS2),HbSS1全长2864 bp,编码806个氨基酸;HbSS2全长2815 bp,编码811个氨基酸。两个基因编码的蛋白具有典型的植物蔗糖合成酶结构特征,包含1个磷酸化位点和两个保守的功能域。半定量RT-PCR分析表明,HbSS1和HbSS2在各组织器官中均有表达,其中HbSS1在叶中的表达量最高,HbSS2在树皮中的表达量最高,这说明HbSS1和HbSS2可能参与了各组织的生长和代谢过程,且功能有所分化。