小麦中两个肉桂酰辅酶A还原酶基因的分离和表达分析

肉桂酰辅酶A还原酶（CCR）负责催化木质素单体生物合成中最重要的代谢反应,它将类苯丙酸类代谢物转移到木质素的合成途径中,为了更好地了解木质素在小麦生长发育中的作用,从小麦（Triticum aestivum L.ev,H4564)中克隆了两个肉桂酰辅酶A还原酶的cDNA,相似性和进化关系的分析表明这两个cDNA片段分别属于不同的肉桂酰辅酶A还原酶,这两个cDNA片段分别命名为W－cr6和W-cr19,RT-PCR和Northen杂交结果证明,W－cr6基因主要在小麦的茎和叶中表达,W－cr19基因主要在根和茎中表达,上述结果表明在小麦的基因组中至少存在两类肉桂酰辅酶A还原酶基因。     

木质素生物合成酶CCR基因的生物信息学分析

肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是催化木质素特异途径的第一个关键酶,是调节碳素流向木质素潜在的控制关节点,对木质素单体的生物合成起着重要作用。通过NCBI数据库收集来自裸子植物、单子叶植物及双子叶植物的35条CCR基因的完整信息,对35条CCR基因的cDNA及其编码的氨基酸序列的进化规律、理化性质、结构域、导肽、信号肽、跨膜结构域、亲/疏水性以及蛋白质结构等性状进行了生物信息学分析与预测,构建了CCR基因的系统发育树。分析结果表明,单子叶植物CCR基因中GC的含量明显高于双子叶植物;CCR基因编码的氨基酸序列存在9个保守区域;所编码氨基酸的理化性质基本一致,但单子叶、双子叶及裸子植物的CCR基因编码主要氨基酸的种类和含量存在着差异;CCR蛋白的N-端存在一个脱氢酶/差向异构酶/辅酶Ⅰ结合蛋白的结构域,无导肽、信号肽及跨膜结构域,属亲水性蛋白;进化树绘制以及同源建模结果表明,CCR基因的进化和植物的进化基本一致,CCR蛋白三级结构模型的空间结构稳定,建模结果可靠。分析结果对于深入研究CCR蛋白在木质素合成中的作用具有一定的理论指导意义。     

菊芋HtCCR1基因的克隆与表达分析

肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是木质素合成代谢的关键酶。该研究以菊芋(Helianthus tuberosus L.)‘廊芋8号’为材料,克隆到1个菊芋的CCR基因,命名为HtCCR1(GenBank登录号为MN205540),其开放阅读框(ORF)长975bp,编码324个氨基酸,其中含有FR_SDR_e保守结构域。系统进化分析表明,HtCCR1与向日葵CCR蛋白(XP_021989763.1)共聚于一支,二者亲缘关系最近。实时定量PCR分析表明,HtCCR1基因在菊芋茎和叶中的表达量显著高于在根和块茎中;盐(150mmol·L-1 NaCl)胁迫处理6、12和24h后,处理组HtCCR1基因的表达量均显著高于对照组;干旱(20%PEG6000)胁迫6和12h后,处理组HtCCR1基因的表达较对照组均显著上调。成功构建pET-28a-HtCCR1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导出了符合预期大小的蛋白,表明HtCCR1重组蛋白已成功表达。该研究结果为进一步研究HtCCR1基因的功能及利用基因工程手段调节菊芋中木质素的生物合成奠定了基础。     

柠条锦鸡儿肉桂酰辅酶A还原酶基因克隆和分析

肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是木质素特异合成途径中的关键酶。根据已报道的植物CCR基因序列设计简并引物,利用RACE技术,首次从柠条锦鸡儿(Caragana korshinkii Kom.)中克隆得到CCR基因全长cDNA序列,命名为CkCCR,GenBank登录号为HQ829859。该序列长1 270bp,具备长度为1 014bp的完整开放阅读框(ORF)。推导该基因编码的蛋白质有434个氨基酸,预测等电点6.69,分子量36.76kDa。序列分析发现,柠条锦鸡儿CCR基因推导的氨基酸序列与其它植物来源的CCR序列高度相似,并且具有植物CCR共有的氨基酸序列"KNWYCYGKA"以及NADPH的结合序列。系统进化分析显示,柠条锦鸡儿CCR与拟南芥CCR2处于同一分支,与同属豆科的银合欢CCR亲缘关系最近。利用荧光定量PCR技术对柠条锦鸡儿一个月龄幼苗基因转录水平进行检测,结果显示CkCCR基因在根、茎、叶中广泛表达,并且干旱处理初期表达量有所下降,处理后期又恢复到未处理时的表达水平。     

植物肉桂酰辅酶A还原酶基因克隆研究进展

木质素单体合成的过程中涉及了许多酶的参与,而肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)是该过程中的一个关键酶。综述了CCR基因在植物体内的克隆、基因功能及在植物组织中的表达情况,并介绍了该基因在植物的抗病虫害和抗逆性研究、饲草和能源上的应用潜力,为进一步研究CCR基因生物学功能和利用奠定了基础。     

巴西橡胶树的脂酰辅酶A还原酶cDNA克隆及其序列分析

从巴西橡胶树差减cDNA文库中筛选到一个与脂酰辅酶A还原酶同源性较高的基因片段,根据该基因片段序列信息,设计特异引物,采用RACE进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得长度为1365bp的cDNA克隆R28（GenBank登陆号：AY461413）。序列分析表明,该基因包含1149bp的开放阅读框,5＇-UTR为96bp,3＇-UTR为128bp,编码382个氨基酸,推测其蛋白质的分子量为43．5kDa,等电点为8．97,有一个跨膜螺旋N（187至215位氨基酸）和1个由17个氨基酸组成的信号肽（1至17位氨基酸）。R28含有脂酰辅酶A还原酶的保守（NADP结合蛋白保守区）,推测该基因是一个脂酰辅酶A还原酶基因。     

亚麻中雄性不育基因同源序列MS2-F的克隆和表达分析

用同源序列克隆法从亚麻中克隆了雄性不育基因同源序列MS2-F cDNA(登陆号:EU363493).该cDNA全长1 91lbp,包含一个1 608 bp的ORF,编码535个氨基酸.推导的蛋白质序列中包含2个雄性不育保守区:NAD结合区域和雄性不育C-末端区域.该基因与油菜和拟南芥雄性不育基因的一致性分别为59.65%和59.16%,为花蕾特异表达基因,推测在亚麻花粉发育过程中与脂酰辅酶A还原酶有相似功能.MS2-F cDNA对应的gDNA大小为2 696 bp(登陆号:EU365361),含有8个内含子和9个外显子.     

尾巨桉HMGR基因的克隆及表达分析

基于RACE技术克隆得到尾巨桉3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(EuHMGR)基因全长为1955bp,包含1560bp的开放阅读框(ORF),编码519个氨基酸。生物信息学分析表明EuHMGR包含两个HMG-CoA结合基序和两个NADP(H)结合基序;同源建模得到EuHMGR三维构象呈"V"型,包含N-结构域、S-结构域和L-结构域。将EuHMGR组DNA与cDNA序列进行比对表明EuHMGR存在一个319bp的内含子。通过实时定量PCR进行组织特异性表达分析表明EuHMGR在茎中的表达量最高,叶次之,在根中基本无表达。该研究为后续尾巨桉EuHMGR的功能验证以及遗传转化奠定基础。     

家蚕MYST组蛋白乙酰转移酶基因Bm-mof的克隆表达和转录活性检测

MYST组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase, HAT)广泛存在于从酵母到人的真核生物中,在真核生物的转录调控中起着重要的作用。利用NCBI已登录的其他物种该基因的氨基酸序列与家蚕的基因组框架图和表达序列标签（expressed sequence tags, EST）数据库进行电子克隆,获得了家蚕中的同源基因。该基因长1 575 bp（GenBank登录号为DQ442997）,开放阅读框(ORF)长1 326 bp,无内含子。基因编码442个氨基酸,预测蛋白质的分子量为51.4 kD。序列中有HAT核心结构域、锌指结构域和染色质域3个保守的结构域,与其他物种同源基因具有较高的序列相似性。RT-PCR结果表明该基因在本实验所检测的家蚕各时期和组织中均有表达。将该基因用亚克隆的方法导入到pET50b载体中并成功地进行了原核表达,表达出了带有6个组氨酸和1个Nus·Tag标签的重组蛋白。     

毛竹SBP转录因子基因的全基因组鉴定和表达分析

SBP是一类植物特有的转录因子,在调节花发育、信号转导和抗逆反应中均具有重要作用。为研究毛竹(Phyllostachys edulis)中SBP的分子特征和表达模式,开展了全基因组序列分析。结果表明,毛竹含有32个基因编码SBP转录因子,依次命名为PeSBP1~PeSBP32,各基因的结构差异明显,外显子数量2~11个不等,其中15个SBP基因具有mi R156的结合位点。蛋白结构分析显示,PeSBPs具有2个典型的保守锌指结构域结合位点,且具有核定位信号。系统进化分析表明,32个PeSBPs隶属于8个亚类,且与水稻的亲缘关系最近。表达模式分析表明,32个PeSBPs在叶、鞭、根、20 cm笋、50 cm笋、早花期花序和晚花期花序等7个组织中的表达差异明显,呈现出不同的表达模式。本研究为深入研究毛竹SBP转录因子家族的功能提供了参考依据。     

中间锦鸡儿CCR2和CCR3基因的克隆和功能鉴定

肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoAreductase,CCR)是催化木质素合成特异途径的第一个限速酶,对木质素的合成起关键作用。从中间锦鸡儿中克隆了两个CCR基因,CiCCR2和CiCCR3,其中CiCCR2基因开放阅读框为897bp,编码299个氨基酸,CiCCR3基因开放阅读框为966bp,编码322个氨基酸。过表达CiCCR2和CiCCR3转基因拟南芥株系幼苗期和成熟期木质素含量均高于野生型,组织化学染色也表明转基因株系木质素积累较野生型拟南芥多,且转基因株系鲜重和干重显著高于野生型。     

牛樟芝HMGR基因的克隆和表达分析

为研究牛樟芝(Antrodia camphorata)萜类生物合成MVA途径中关键酶3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutary CoA reductase,HMGR)的调控机制,从牛樟芝基因组中分离并克隆出AcHMGR基因,对其进行生物信息学分析、不同碳氮源添加物对该基因的诱导表达情况进行分析。分析显示:AcHMGR基因含7个外显子、6个内含子;开放阅读框为3 402 bp,编码1 133个氨基酸残基组成蛋白质序列;AcHMGR包含HMGR典型的多肽位点,即2个HMG-CoA结合基序:PLG(Ⅰ/Ⅴ)AGPLK(Ⅰ/Ⅴ)DG和AEGTLVASTSRG,2个NADP结合基序:TGDAMGMNMI和IEVGT(Ⅰ/Ⅴ)GGGT;分子系统进化分析显示,AcHMGR蛋白序列与其他多孔菌科真菌的HMGR聚为一支;表达谱分析显示:碳源中的果糖、氮源中的酪蛋白胨诱导表达AcHMGR基因的能力最强。本研究为探讨牛樟芝萜类,尤其是三萜类化合物的生物合成及调控机理提供了帮助。     

乙烯利诱导胶乳基因HbEtIe的克隆与表达分析

在成功构建巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳差异表达cDNA消减文库的基础上,利用RACE技术成功克隆了一个新的乙烯利诱导表达胶乳基因HbEtIe。分析表明,该基因含有1个158 bp的内含子和2个长度分别为92 bp和178 bp的外显子;cDNA全长551 bp,包含1个270 bp的完整阅读框,174 bp的3′-UTR和107 bp的5′-UTR,推导氨基酸序列中含有一个未知功能结构域DUF581。HbEtIe基因在乙烯利刺激条件下的胶乳中特异性表达并受到乙烯利的调控,其表达量随处理时间的延长而增强。HbEtIe基因与拟南芥衰老相关基因SAG102具有较高的同源性暗示,HbEtIe可能参与了乙烯利诱导巴西橡胶树乳管衰老的分子调控。     

毛竹TCP基因家族全基因组鉴定与分析

TCP蛋白是植物特有的一类转录因子,在植物生长、发育、信号转导以及生理生化刺激响应等方面具有重要功能。毛竹(Phyllostachys edulis)是世界上生长速度最快的植物之一,在中国具有重要的经济、生态和社会价值。为了解TCP基因家族在毛竹基因组中的数量和表达,本研究利用生物信息学方法对毛竹TCP基因家族进行全面概述,包括基因结构、进化关系、保守结构域和表达模式等。结果显示,毛竹基因组中含有19个基因编码TCP转录因子,依次命名为Phe TCP1-Phe TCP19,蛋白质大小为100～406 aa,等电点为4.85～10.70,均是疏水性蛋白;PheTCPs基因结构较为简单,大部分不含内含子;发现所有PheTCPs转录因子具有高度保守的TCP结构域;19个PheTCPs隶属于2个组:ClassⅠ和ClassⅡ,ClassⅡ进一步划分为CIN、CYC/TB1两个亚类。表达模式分析表明,19个PheTCPs在毛竹不同笋和花发育时期中的表达差异明显。本研究为进一步探索毛竹TCP基因家族各成员的功能提供一定的理论基础。     

基于转录组测序的慈竹笋木质素基因筛选及其表达分析

慈竹（Bambusa emeiensis）纤维素含量丰富,是较好的造纸原料,但竹茎中木质素影响着制浆生产及纸浆质量。目前,对慈竹木质素生物合成机制所知甚少,这限制了遗传调控竹木质素的研究。本文以拟南芥、水稻等植物的已知木质素基因作为查询序列,通过BLASTp和系统进化分析,从10、50、100和150 cm慈竹笋转录组数据中筛选到351个木质素生物合成相关Unigenes,包括51个LAC,37个4CL、26个PAL、34个CCR和25个CAD相关转录子,其数量高于其他已报道的竹类植物。转录丰度和定量基因表达分析发现16个木质素基因,包括2个PAL、5个CCR、3个4CL、2个CADH2和4个LAC,随着笋发育而表达上调,表明其可能与发育性木质素积累相关。     

丹参肉桂酰辅酶A还原酶基因克隆与生物信息学分析

分析丹参转录组数据库,获得一条新的肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoA reductase,CCR)基因,命名为SmCCR-2(GenBank注册号为JF784010)。该基因包含一个长为966 bp的完整开放读码框,编码321个氨基酸残基。生物信息学分析显示,SmCCR-2编码的蛋白具有NWYCY基序,属于NABD_Rossmann超家族,相对分子量为35.80 kD;预测SmCCR-2为中性亲水的稳定蛋白,存在跨膜结构域。实时荧光定量PCR结果表明,SmCCR-2基因在丹参各组织都有表达,茎中表达量最高。其表达受到病原菌的影响,表明SmCCR-2基因可能与植物防御反应有关。     

慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶(C3H)是调控植物木质素生物合成的关键酶,本文以慈竹为材料,利用RT-PCR技术克隆慈竹C3H基因,并对其进行生物信息学分析,为通过基因工程手段降低工业用竹木质素含量奠定基础。结果表明,该cDNA序列全长为1 581 bp,编码区为1 539 bp,编码512个氨基酸,蛋白分子量为58.33KD,等电点为9.09;氨基酸序列和结构分析显示C3H有一个保守区域,即P450结构域。系统进化分析表明,该基因与毛竹和水稻的C3H基因具有很高的同源性。慈竹与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白为亲水性蛋白,这三种编码蛋白很可能定位在内质网(膜)上,其编码蛋白的二级结构及三级结构都含有丰富的α-螺旋和无规卷曲,β-转角和延伸链的含量较少,都含有2个相对保守的无序化区域。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为JF693629,可能与慈竹木质素的生物合成有关。     

毛竹7个COBL基因的分子特征及表达分析

COBL家族基因编码糖基磷脂酰基醇锚定蛋白,主要参与调控植物细胞壁纤维素的含量和细胞的定向伸长.研究毛竹COBL基因的分子特征和表达模式,对揭示其材性快速形成机制具有重要意义.利用生物信息学方法对毛竹COBL家族成员进行全基因组分析,共鉴定出7个具有完整保守结构域的COBL家族基因成员(PeCOBL1～PeCOBL7),其内含子数量为0～7个,编码的蛋白均具有CCVS保守结构域和潜在的ω位点,仅4个成员(PeCOBL3,PeCOBL4,PeCOBL5和PeCOBL7)具有CBM功能域.亚细胞定位预测表明,PeCOBLs均定位于细胞膜上,为膜蛋白,属于GPI-APs超家族.系统进化与蛋白motifs预测分析发现,PeCOBLs各成员与水稻的亲缘关系更为接近,其氨基酸序列同源性更高.RT-qPCR结果显示,PeCOBLs在毛竹不同组织中的表达存在明显差异,其中在展开叶中表达量高(低)的基因,在未展开叶中表达量则相对较低(高);PeCOBLs在毛竹不同高度笋基部第一节的上、中、下三部分的表达量均存在一定的差异.基因共表达分析表明,PeCOBLs与多种蛋白酶基因呈现正向共表达,其中包含纤维素酶5和类纤维素合成酶D2基因,表明PeCOBLs参与纤维素合成的功能是与其他基因共同实现的.本研究为深入开展PeCOBLs功能研究提供了参考,有助于揭示该家族成员在调控毛竹纤维素含量和细胞定向伸长中的作用机制.     

青花菜雄性不育相关基因BoDHAR的克隆与表达分析

以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段的序列为信息探针,通过在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索,经人工拼接、RT-PCR、PCR克隆与序列分析,获得了青花菜脱氢抗坏血酸还原酶DHARdehydroascorbatereductase基因的cDNA与DNA全长序列,命名为BoDHAR。并利用双链接头介导PCR的染色体步行技术(genomewalking)克隆了其上游644bp的5′端序列。所获的BoDHAR基因全长1486bp,存在两个内含子,DNA编码区序列633bp,编码210个氨基酸;序列分析表明BoDHAR与同源基因AT1G19570.1cDNA序列有82.3%的一致性,推导的氨基酸序列有79.6%的一致性;编码的水溶性蛋白存在多个磷酸化位点;5′端上游区存在明显的转录调控序列。半定量RT-PCR结果表明BoDHAR在可育系花蕾中的表达量明显高于不育系花蕾,在花药中的表达明显高于其它部位。     

罗汉果色氨酸转氨酶基因SgTAR2的克隆及表达分析

色氨酸转氨酶基因家族,是直接参与植物生长素生物合成途径的关键酶基因。该研究在罗汉果转录组测序的基础上,结合RACE技术克隆罗汉果色氨酸转氨酶基因SgTAR2的全长cDNA序列和DNA序列;并对其进行生物信息学分析和时空表达分析。结果表明:克隆所得SgTAR2的cDNA全长序列2078bp,最长ORF为1332bp,编码443个氨基酸,Gen Bank登录号为KU949381,其编码蛋白具有2个蒜氨酸酶保守结构域和多个5'-PLP结合位点,推测其可能参与催化色氨酸转氨基作用、化学防御作用、生长素生物合成等生物学过程;SgTAR2基因DNA长为4103bp,含有4个内含子和5个外显子,其内含子具有多个高水平转录调控因子和多个与激素、环境等胁迫响应相关的作用元件,暗示SgTAR2基因内含子协同调控罗汉果生长素合成、抗胁迫反应、形态发育等生物学过程。实时荧光定量结果显示,SgTAR2基因在罗汉果各组织器官均有表达,在雌蕊和15d幼果期表达量较高,暗示该基因参与罗汉果果实早期发育。该研究结果表明SgTAR2参与了生长素介导的罗汉果不同生长发育过程,特别对幼果及花的起始发育和器官形态建成等具有重要意义。