翅碱蓬CMO cDNA基因克隆、测序及重组植物表达载体的构建

从翅碱蓬叶片中提取总RNA,根据相关同源序列设计引物,使用反转录试剂盒进行RTPCR,扩增得到翅碱蓬胆碱单加氧酶(CMO)cDNA,进行PCR产物测序;然后将CMO cDNA T-A克隆至pMD18-T-simple载体上,经测序正确后亚克隆至pBI121植物表达载体,进行酶切及克隆测序鉴定.     

翅碱蓬氨基酸、蛋白质和脂肪酸成分的研究

翅碱蓬(Suaeda heteroptera)是广泛分布于我国北方滨海盐碱地的藜科植物。到目前为止,对翅碱蓬的有用化学成分和生理生化特性还没有进行过仔细的研究。仅报道过种子含油量测定的结果。因此对翅碱蓬的开发和利用缺少足够的资料。我们从分析种子和茎叶蛋白质、氨基酸和脂肪酸成分入手,探讨翅碱蓬种子作为人类食品,茎叶作为牲畜饲料的可能性。     

翅碱蓬对镉的耐性及吸收特性的研究

重金属Cd具有高毒性, 对生物体危害较大。盘锦红海滩优势物种翅碱蓬能够吸收一定量的重金属, 因此可用于湿地滩涂污染的原位修复。通过水培的方法, 以翅碱蓬为研究对象, 测定不同浓度Cd胁迫下翅碱蓬的根长、苗高、鲜重、叶绿素含量、及根、茎、叶内Cd的含量, 探讨Cd对于翅碱蓬生长发育的影响以及对Cd的吸收规律。结果表明: 低浓度Cd对翅碱蓬的根长和苗高起到促进作用, 而低浓度 Cd对翅碱蓬根长和苗高生长起到抑制; 无论低浓度还是高浓度, 对翅碱蓬鲜重均具有一定的抑制作用, 抑制强弱表现为20 μg·L-1浓度组>1 μg·L-1浓度组。不同Cd浓度下翅碱蓬叶绿素含量表现为“低促高抑”; 植物各个部位对于Cd的吸收为地下部分>地上部分。     

大凌河口湿地水盐梯度下翅碱蓬的生态阈值

基于大凌河口湿地翅碱蓬生物量、密度、株高、株重等生物指标之间极显著的相关性,选取生物量为指标,研究不同土壤理化因子条件下,翅碱蓬种群分布的变化规律。结果表明:翅碱蓬生物量自然对数分别与土壤盐分、水分含量之间具有极显著的一元二次曲线拟合关系,表明翅碱蓬群落分布受土壤水分、盐分的影响;用高斯模型求解出大凌河口湿地翅碱蓬随土壤水盐变化的生态阈值,翅碱蓬的最适土壤盐分为12.14 g·kg-1,生态阈值区间为5.02~19.26 g·kg-1,最适生态阈值区间为8.58~15.70 g·kg-1;翅碱蓬最适土壤水分为59.82%,生态阈值区间为22.02%~97.62%,最适生态阈值区间为40.92%~78.72%。上述研究结论为河口湿地翅碱莲生境保护与植被修复提供了科学依据。     

翅碱蓬对盐沼沉积物微生物生物量及β-氨氧化细菌群落的影响——以双台河口为例

为了解翅碱蓬植被对盐沼沉积物微生物的影响,于2013年7月、8月、9月和11月对双台河口裸滩和翅碱蓬植被沉积物(10—15 cm)微生物生物量碳(MBC)、微生物生物量氮(MBN)、16S rRNA基因丰度、潜在硝化速率、β-氨氧化细菌(β-AOB)丰度及群落进行了调查。结果表明,不同采样日期裸滩沉积物MBC、翅碱蓬沉积物β-AOB amo A丰度和两种生境潜在硝化速率没有显著差异;而翅碱蓬沉积物MBC、裸滩沉积物β-AOB amo A丰度、两种生境MBN和16S rRNA基因丰度呈现时间波动。当所有采样日期的数据结合分析时,翅碱蓬植被显著影响沉积物MBC、MBN、细菌16S rRNA基因丰度、潜在硝化速率和β-AOB amo A丰度。从裸滩和翅碱蓬沉积物获得的β-AOB序列属于Nitrosospira和Nitrosomonas,翅碱蓬植被对β-AOB群落结构和多样性均有一定的影响。研究结果有助于了解翅碱蓬湿地中微生物的作用,为盐沼生境的生态修复技术提供参考。     

盐和重金属复合胁迫对翅碱蓬萌发与生长的影响及调控措施

为探究Zn、Cu与盐复合胁迫对翅碱蓬(Suaeda salsa)萌发生长的影响机理及其调控措施,以翅碱蓬为研究对象,采用水培试验方法,测定Zn、Cu和盐复合胁迫条件下翅碱蓬种子发芽率、萌发速率和幼苗渗透调节物质含量等指标,分析1.5 mg/L吲哚乙酸(IAA)、100 mg/L赤霉素(GA)和0.3%硝酸钾(KNO₃)处理对Zn、Cu与盐复合胁迫条件下翅碱蓬萌发与生长的影响。结果表明：(1) Zn、Cu与高盐复合胁迫极显著降低翅碱蓬种子的发芽率,中高浓度的Zn、Cu与盐复合胁迫极显著降低翅碱蓬种子的萌发速率,Zn、Cu和盐复合胁迫对翅碱蓬种子的萌发生长影响表现为低促高抑效应,影响因子间存在明显的协同效应;(2)Zn、Cu和盐复合胁迫条件下,随着盐浓度的升高,翅碱蓬幼苗体内过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)3种抗氧化酶活性呈先升高后降低的变化趋势,Zn、Cu和高盐复合胁迫使翅碱蓬幼苗体内丙二醛(MDA)含量增加近2.5倍;(3)1.5 mg/L IAA溶液浸种12 h可显著提高Zn、Cu与高盐复合胁迫条件下翅碱蓬种子的发芽率和萌发速...     

松嫩平原两种碱蓬群落土壤种子库通量及幼苗死亡的分析

角碱蓬和翅碱蓬都是１ａ生耐碱性较强的藜科植物。在松嫩平原碱化草甸２个固定的单优碱蓬群落土壤中有活力种子的数量动态和种群动态的研究结果表明：土壤种子库存量在尚未萌发输出以前为最大,角碱蓬群落为２２２６０粒／ｍ＾２,翅碱蓬群落为３７２３０粒／ｍ＾２。整个生长季均有种子输出,２群落的种子库存率随着时间呈渐近形式规律地下降。现存植株数量角碱蓬种群以５月上旬最大,为１９４８０株／ｍ＾２,翅碱蓬则在４月上旬最     

湿地翅碱蓬生长及渗透调节物质对盐度的响应

辽河口翅碱蓬湿地是濒危物种黑嘴鸥的主要栖息地,其生长情况受海陆交汇带的盐分影响显著,近年来退化严重。探究适宜翅碱蓬生长的盐分范围对保护黑嘴鸥有重要意义。采用生长模拟装置,在翅碱蓬生长期内施用浓度为0、150、300、450和600 mmol·L~(-1)盐溶液,模拟不同盐环境条件下,翅碱蓬生长状况及生理指标对盐度的响应。结果表明:盐浓度为300 mmol·L~(-1)时,翅碱蓬地上高度及根长达到最大,分别为45.6 cm和14 cm;地上部分和根部的游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白质3种渗透调节物质含量均达到最大值,分别为0.82和0.58、8.46和6.86、22.26和19.36 mg·g-1;盐浓度达到450 mmol·L~(-1)时,翅碱蓬植株的株高和根长降低,渗透调节物质含量也有减少;在浓度为600 mmol·L~(-1)时,表现出生长缓慢、茎枝枯黄、叶片脱落等现象,甚至出现翅碱蓬植株死亡。在盐浓度低于300mmol·L~(-1)时,翅碱蓬各项生长指标和渗透调节物质都处于上升趋势。研究表明,适当的盐浓度可促进翅碱蓬生长,辽河口湿地翅碱蓬生长的适宜盐度范围是150~450 mmol·L~(-1),在盐浓度为300 mmol·L~(-1)时长势最好,超过600 mmol·L~(-1)时翅碱蓬无法生长。     

盐生植物翅碱蓬的内生真菌多样性分析

【目的】对辽宁省盘锦市双台子河口国家自然保护区的盐生植物翅碱蓬(Suaedaheteroptera Kitag.)的内生真菌进行研究。【方法】利用传统分离方法对翅碱蓬的根、茎、叶组织进行分离和纯化,根据形态学和理化特征,并结合rDNA-ITS序列分析对菌种进行鉴定。【结果】共分离得到内生真菌49株,这些内生真菌分属于13个属,其中小丛壳菌属(Glomerella)、链格孢属(Alternaria)、毛盘孢属(Colletotrichum)和枝孢属(Cladosporium)为优势菌属。翅碱蓬的内生真菌分布具有一定的组织特异性,两种不同生境中的翅碱蓬内生真菌群落丰富度差异较小,相似度较高,但在某些种属上存在特异性。【结论】翅碱蓬体内含有丰富的内生真菌资源,其内生真菌具有很高的宿主特异性,而且其分布受生境影响。     

抗冻蛋白(afp)基因表达载体的构建及对香蕉胚性细胞悬浮系的转化

通过PCR从‘京都七寸人参'胡萝卜基因组DNA中扩增抗冻蛋白基因,测序结果表明该基因的核苷酸序列与从宁夏‘吴忠'胡萝卜中克隆的完全一致。先后将获得的胡萝卜afp基因克隆和亚克隆至pMD18-T和pBI121,构建植物表达载体pBI121-afp。通过冻融法将pBI121-afp导入根癌农杆菌EHA105中。以香蕉栽培品种‘北大矮蕉'的胚性细胞悬浮系为受体,采用农杆菌介导法将胡萝卜afp基因导入其中,然后在Kanamycin的选择压力下通过体细胞胚发生途径进行植株再生。共获得抗性再生植株9株,其中两株经PCR检测呈阳性,可初步确定目的基因已经整合到这两株转基因香蕉植株的基因组中。     

甜味蛋白thaumatin基因转入烟草的研究

利用基因工程技术 ,将分别克隆在两个不同载体上的甜味蛋白 thaum atin c DNA基因片段连接成一个完整的 c DNA基因 ,并将该基因克隆进 p BI12 1,构建成表达载体 p BI12 1- tha.通过冻融法导入农杆菌 ,农杆菌介导叶盘法转入烟草 ,经过组培 ,得到转基因的植株 .提取转基因烟草总 DNA,经 PCR,PCR- Southern和 Southern杂交证实 ,甜味蛋白基因已整合到烟草基因组中 .RT- PCR结果证明 ,thaumatin基因已在转基因烟草中转录成 m RNA,但SDS- PAGE和甜味尝试都表明 thaumatin基因在转基因烟草中没有表达出甜味蛋白     

香蕉花叶病毒外壳蛋白基因克隆及表达载体的构建

从海南大田感染香蕉花叶病的香蕉叶片 ,获得香蕉花叶病毒 ,提纯其 RNA,在 AMV反转录酶作用下合成 c DNA第一链 ,经 PCR扩增 ,获得一约 70 0 bp的 DNA片段 ,测序结果显示所克隆的 DNA片段包含一完整的香蕉花叶病毒株系 ( CMV-BHI)外壳蛋白基因 ,长度为 6 5 7bp,然后将此 DNA片段 ,分别克隆到p BI1 2 1和 p KHG4质粒 ,构成两个含 Ca MV35 s启动子 ( 5 '-端 )、NOS终止子 ( 3'-端 )和分别含 NPT 标记基因和 NPT 及 HPT标记基因的植物表达载体 ( p TBB和 p TBK)。然后用 p AHC1 8中的 UBI promoter换下p BI1 2 1的 Ca MV35 s promoter,构成 p BIAH;再用 CMV-BHI外壳蛋白基因换下 p BIAH中 GUS基因 ,构成一含单子叶植物启动子 UBI和 NPT 标记基因的植物表达载体 ( p TBBU)。从而为 CMV-BHI外壳蛋白基因在香蕉中表达打下了基础     

拟南芥冷诱导型启动子CBF 3的克隆及活性检测

目的：构建冷诱导型启动子CBF3基因的植物表达载体,并将其转入烟草。方法：以拟南芥基因组DNA为模板,通过特异PCR扩增,克隆冷诱导表达启动子CBF3（C-repeat binding factor）。用CBF3启动子替换pBI121载体上的35S启动子构建新的载体pBC-GUS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草。结果：获得了转基因烟草,转基因烟草的GUS组织化学染色及PCR分析结果表明,在低温诱导下,CBF3启动子可增强GUS基因表达。结论：CBF3启动子可应用于植物抗冷基因工程研究。     

ggpps 5'-侧翼序列的克隆及其启动子功能验证

目的:研究牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPs)基因启动子的活性;方法:从曼地亚红豆杉细胞中克隆ggpps基因5'-侧翼序列,并将该侧翼序列代替pBI121质粒上的CaMV35S启动子,以Gus基因作为报告基因构建植物表达载体,并进一步导入农杆菌LBA4404中获得阳性转化子,然后用叶盘转化法验证该侧翼序列的启动子活性;结果:本研究从曼地亚红豆杉细胞中成功克隆了ggpps基因的5'-侧翼序列,并且验证了该侧翼序列具有启动子活性;结论:ggpps基因的5'-侧翼序列的测序结果表明本实验成功克隆了该侧翼序列,启动子功能验证结果表明ggpps 5'-侧翼序列具有启动子活性,这些结果为进一步的通过缺失法进行ggpps基因启动子功能研究奠定了基础.     

拟南芥春化相关基因VRN2的克隆及其植物表达载体的构建

本文利用特异性引物,从拟南芥RNA中提取春化相关基因VRN2 cDNA序列,GenBank登录号AY063047。该基因序列大小为1 354 bp,编码区为1 323 bp,编码氨基酸441个。将克隆片段插入中间载体pBPFΩ7,经PstI酶切回收带有P35S启动子和nos终止子片段,连接pBI121载体,构建VRN2基因的植物表达载体。     

利用基因枪法将Tagsk1基因导入敏盐小麦成熟胚愈伤组织提高其耐盐性的研究

以Tagsk1(TriticumasetiumL.glycogen synthase kinase1)基因的cDNA的碱基序列为基础,设计特异引物由小麦耐盐突变体RH8706-49基因组DNA进行扩增后,得到来自于基因组的Tagsk1基因。采用基因枪法,利用携带该基因的双元表达载体pBI121-gsk1转化敏盐小麦H8706-34和中国春的成熟胚愈伤组织,经Kanamycin和0.5%NaCl筛选获得耐盐愈伤组织。这些被转化的愈伤组织表现出较高的耐盐性,并且能够在含盐培养基上进一步分化出根和芽。     

云南红豆杉紫杉烯合成酶基因克隆、序列分析与植物表达载体的构建

利用分段RT—PCR法成功地从云南红豆杉叶片总RNA中分离出两条长约1．4kb和1．5kb的cDNA片段,克隆到pUCm—T载体中,序列拼接分析表明,该cDNA片段与Wildung MR等发表的紫杉二烯合成酶基因编码区2586bp有41个核苷酸不同,同源性为98．42％,具有编码862个氨基酸蛋白质的能力．为了检测所克隆的基因编码产物是否具有活性,并进一步制备抗体以便于将来转基因植物的检测,构建了一个酵母表达载体GAPA-T14;为了转化植物构建了两个具有不同启动子的植物表达载体,pBI121-T14(含35S启动子)和pBIH-T14(在pBI121的基础上以胶乳特异启动子取代35S启动子)．     

辣椒ML基因植物表达载体的构建及其转化

为分析辣椒ML基因在抗辣椒疫病方面的作用,构建了ML基因的植物表达载体pBI121-ML,采用快速冻融法将表达载体导入农杆菌EHA105,并用农杆菌介导法转化辣椒感病品种B12,对得到的转化植株经PCR和RT-PCR分子检测,结果显示,获得了4个辣椒转基因株系.