油橄榄HMGR基因家族的克隆表达及功能验证

3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-Co A)生成甲羟戊酸(MVA),是MVA途径中第一个关键酶。油橄榄是一种重要的经济油料作物,其含有的萜类物质具有重要营养价值,但关于调控萜类物质代谢途径的关键基因研究较少。为研究萜类合成途径关键酶基因HMGR,本研究采用RT-PCR法克隆油橄榄HMGR基因,进行生物信息学分析及构建原核表达载体,对表达蛋白生物活性进行功能验证,并采用荧光定量PCR分析HMGR在油橄榄不同生长阶段的表达量。结果表明:克隆出油橄榄HMGR基因家族的三个基因,分别命名为Oe HMGR1、Oe HMGR2、Oe HMGR3,m RNA ORF的长度分别为1 713 bp、1 773 bp、1 737 bp,编码570、590、578个氨基酸;基因编码蛋白均有2个跨膜区及HMGR催化活性的结构域,不含信号肽;构建了原核表达载体p ET30b(+)-Oe HMGR,转入到大肠杆菌BL21中成功表达,3个重组酶蛋白分子量大小均在66.2~68.0 k D之间,分离纯化重组蛋白进行功能验证,GC-MS检测表明该蛋白具有HMGR催化活性功能;荧光定量PCR分析表明该家族基因在果实和叶片中表达量较高,而在根、茎、花中表达量较低,在开花后45 d、90 d、120 d表达量较低,但在花后165 d表达量上升至较高水平。该研究为进一步鉴定Oe HMGR的功能及油橄榄萜类物质的合成生物学研究奠定基础。     

牛樟芝HMGR基因的克隆和表达分析

为研究牛樟芝(Antrodia camphorata)萜类生物合成MVA途径中关键酶3-羟-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutary CoA reductase,HMGR)的调控机制,从牛樟芝基因组中分离并克隆出AcHMGR基因,对其进行生物信息学分析、不同碳氮源添加物对该基因的诱导表达情况进行分析。分析显示:AcHMGR基因含7个外显子、6个内含子;开放阅读框为3 402 bp,编码1 133个氨基酸残基组成蛋白质序列;AcHMGR包含HMGR典型的多肽位点,即2个HMG-CoA结合基序:PLG(Ⅰ/Ⅴ)AGPLK(Ⅰ/Ⅴ)DG和AEGTLVASTSRG,2个NADP结合基序:TGDAMGMNMI和IEVGT(Ⅰ/Ⅴ)GGGT;分子系统进化分析显示,AcHMGR蛋白序列与其他多孔菌科真菌的HMGR聚为一支;表达谱分析显示:碳源中的果糖、氮源中的酪蛋白胨诱导表达AcHMGR基因的能力最强。本研究为探讨牛樟芝萜类,尤其是三萜类化合物的生物合成及调控机理提供了帮助。     

茅苍术两个HMGR基因(AlHMGR)的克隆与分析

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是植物萜类化合物生物合成的关键酶,在茅苍术挥发油生物合成过程中起重要作用,但目前茅苍术AlHMGR全长序列尚不清楚。本研究在前期茅苍术转录组学研究的基础上,筛选AlHMGR序列,并进行其c DNA序列的全长克隆,然后分析AlHMGR的序列特征及其编码蛋白的结构特征。结果显示,所得两条AlHMGR全长cDNA序列分别为1 749 bp和1 770 bp,分别编码582个和589个氨基酸;系统进化分析表明与菊科植物朝鲜蓟亲缘关系最近。本研究还探讨了AlHMGR编码蛋白的氨基酸序列特征、蛋白结构特征及亚细胞定位。本研究结果为进一步阐明茅苍术萜类化合物生物合成和调控的分子机制提供了理论依据。     

茶树甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因CsMVD的克隆与表达分析

该研究在茶树转录组测序的基础上,以茶树品种‘福鼎大白茶’的芽叶为供试材料,采用RT-PCR技术,克隆茶树萜类化合物合成途径中的限速酶——甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶全长cDNA序列,命名为CsMVD(GenBank登录号为MF772780);该基因全长1 585bp,其ORF为1 266bp,编码421个氨基酸,蛋白质分子量46.45kD,理论等电点7.10。CsMVD蛋白可能定位于细胞质中,具有MVD1superfamily的保守结构域,不存在跨膜结构和信号肽,具有多个磷酸化位点,部分保守的氨基酸残基决定了蛋白的催化反应特异性和活性。系统进化分析表明,CsMVD与新疆紫草(Arnebia euchroma)MVD的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,CsMVD在茶树不同组织中均有表达,果实中CsMVD的表达量最高,表达水平表现为:果实茎根叶花;在白茶萎凋过程中,CsMVD基因的表达量在48h结束阶段显著高于0h,推测该基因与茶叶萜类香气化合物形成有关。     

茶树1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因CsDXS1的克隆与表达分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)是MEP萜类合成途径的第一个关键酶,在植物萜类物质的生物合成过程中发挥重要的作用。以福鼎大白茶为实验材料,在课题组前期转录组数据的基础上,运用RT-PCR技术克隆了茶树Cs DXS1基因的完整开放阅读框(ORF)。该ORF长度为2 154 bp,编码717个氨基酸。生物信息学分析结果表明,茶树Cs DXS1蛋白与其他植物的同源蛋白相似性高达85%-90%,属于DXS基因家族的I类基因,该蛋白是不稳定的亲水蛋白,不存在信号肽和跨膜结构域,有15个可信度高的磷酸化位点,具有典型的转酮醇酶亚家族功能域。利用实时荧光定量PCR对Cs DXS1基因在茶树不同组织和不同激素处理下的表达谱进行检测,结果显示:不同组织中,Cs DXS1基因的表达水平在第三叶中最高,嫩叶中的表达量显著高于茎和老叶,表达水平从高到低依次为第三叶第四叶第二叶第一叶嫩茎老茎老叶。在不同激素处理中,Cs DXS1的表达量受到不同程度的诱导,且表达量峰值的出现时间存在差异。Cs DXS1在IAA和ABA激素处理下的表达量峰值最高(4 h),均为对照的1.5倍,在Me JA处理下表达量峰值最低(24 h),仅为对照的1.1倍。     

南京椴HMGR基因的克隆和功能验证

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR）是植物萜类代谢中甲羟戊酸途径的关键酶,本研究运用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,首次从珍稀植物南京椴中克隆出HMGR的全长基因TmiHMGR,其长度为2 160 bp,包含一个1 758 bp的开放阅读框,其推导蛋白TmiHMGR编码585个氨基酸残基,相对分子量为62.9 kD,pI为6.11。将TmiHMGR与其他植物HMGR氨基酸序列构建进化树,结果显示TmiHMGR与苹果的HMGR聚为一枝。采用半定量RT-PCR分析TmiHMGR在根、茎和叶中的表达情况,结果表明该基因在茎中的表达量最高,根和叶中的表达量相对较弱。验证功能的颜色互补实验结果显示,TmiHMGR能够使代谢流明显朝类胡萝卜素合成的方向进行,说明TmiHMGR在萜类产物生物合成中是一个重要因子。     

罗汉果SgHMGR基因的克隆、分析及原核表达

罗汉果甜苷V是一种葫芦烷型四环三萜类物质,作为主要的活性成分和甜味成分存在于成熟果实中,3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)作为萜类化合物生物合成途径中的第一个限速酶,位于甲羟戊酸(MVA)途径中,是罗汉果甜苷V生物合成途径中的重要调控位点。为了深入了解罗汉果甜苷Ⅴ的生物合成途径,该研究从罗汉果转录组数据中获得一条编码HMGR的unigene,以授粉后3 d的幼果作为实验材料,通过RACE技术获得了1 926 bp的全长序列,经过生物信息学软件分析,发现该基因含有1 749 bp的开放阅读框,编码582氨基酸残基,含2段跨膜区,分别位于50~72 aa和93~115 aa,亚细胞定位预测位于质膜或内质网上,预测该蛋白没有信号肽,系统进化树分析显示与同科植物黄瓜和甜瓜中HMGR基因的同源性最高。该研究采取去掉N端跨膜区的方法,构建原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导在上清和沉淀中均有融合蛋白出现,尤其在25℃诱导过夜后上清中表达最明显。该文是首次对SgHMGR基因全长序列的克隆及原核表达的功能验证,为进一步深化SgHMGR基因在罗汉果甜苷V生物合成途径中的功能及分子调控研究打下基础。     

细纹豆芫菁3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

3-羟甲基戊二酰辅酶A-还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR）是甲羟戊酸途径的关键酶。获得芫菁体内HMGR基因信息是确定甲羟戊酸途径与斑蝥素合成相关性的基础。本研究利用RACE技术从细纹豆芫菁Epicauta mannerheimi (Maklin)体内克隆获得HMGR基因全长cDNA序列, 命名为EmHMGR（GenBank登录号为JQ690539）。该基因全长3 118 bp, 其中5′端非翻译区178 bp, 3′端非翻译区414 bp, 开放阅读框2 526 bp, 编码842个氨基酸。推测的蛋白质分子量为92.8 kDa, 理论等电点为6.0, 预测分子式为C₄₁₃₅H₆₆₀₄N1₀₉₈O₁₂₁₆S₅₀, 不稳定系数为43.37, 总亲水性系数为0.091, 为疏水性不稳定蛋白。序列分析发现该基因编码的蛋白与已报道的其他昆虫HMGR的氨基酸序列一致性达50%以上, 而且包含HMGR_Class I保守功能域、 固醇敏感多肽区及HMGR蛋白的其他保守功能位点。系统进化分析发现该基因与叶甲科昆虫HMGR基因的关系最近。本研究首次从芫菁科昆虫体内克隆获得甲羟戊酸途径的关键酶EmHMGR基因, 为后期芫菁体内斑蝥素生物合成途径的研究奠定了基础。     

真核翻译延伸因子1A蛋白家族功能位点的进化踪迹分析

真核翻译延伸因子1A（eEF1A）是真核生物蛋白质翻译过程中能将氨酰tRNA运送到核糖体A位点参与多肽延伸反应的多功能蛋白质. 本文主要利用多种生物信息学分析工具进行地中海涡虫翻译延伸因子1A（SmEF1A）蛋白序列的查找与eEF1A直系同源蛋白的搜索, 并基于90条直系同源蛋白进行eEF1A蛋白家族的进化踪迹分析和SmEF1A蛋白功能位点的比较研究. 结果表明,在eEF1A蛋白家族中共识别到338个踪迹残基位点和20个踪迹残基富集区域,SmEF1A蛋白的功能位点与踪迹残基位点密切相关,与GTP/Mg2+结合相关的S21、T72、D91、G94等重要位点均为全家族保守的踪迹残基,N 糖基化、磷酸化等蛋白修饰位点中踪迹残基位点往往是被修饰的部位或修饰功能发挥的关键辅助位点,而位于分子表面的配基结合口袋则与20个踪迹残基富集区域在分子表面形成的踪迹残基簇关系密切. eEF1A蛋白家族的进化踪迹分析为eEF1A蛋白重要功能区域关键残基的确定和未知功能位点的预测提供了重要信息.     

茶树单萜合成酶CsTPS基因的克隆及表达分析

该研究在茶树转录组测序的基础上,以‘铁观音’茶树品种的芽叶为供试材料,采用RT-PCR技术,克隆了茶树的1条单萜合成酶(TPS)基因全长cDNA序列,命名为CsTPS(GenBank登录号为KY829105)。CsTPS基因全长2 077bp,其开放阅读框(ORF)为1 752bp,编码583个氨基酸。CsTPS基因编码蛋白含有单萜合成酶蛋白特有的2个天冬氨酸富集基序及RRx8W、RxR保守基序,N端具有一段叶绿体转运肽。同源比对分析显示,CsTPS氨基酸序列与多种植物的单萜合成酶序列相似性较高,与黄胡萝卜α-松油醇合成酶、白簕柠檬烯合成酶、蓖麻单萜合成酶相似性分别为74%、71%和66%。系统进化树分析表明,CsTPS属于TPSb亚家族类型。荧光定量PCR结果显示,在白茶萎凋、乌龙茶做青、红茶发酵等加工过程中,CsTPS基因的表达量均有上调,推测CsTPS基因的表达与茶叶加工过程中茶叶香气形成密切相关。     

A Primeverosidase as a Main Glycosidase Concerned with the Alcoholic Aroma Formation in Tea Leaves

We isolated and characterized a primeverosidase from fresh tea leaves (Camellia sinensis var. sinensis cv. Yabukita) as a main glycosidase involved in alcoholic aroma (geraniol, linalool, benzyl alcohol, 2-phenylethanol, linalool oxides etc.) formation from their aroma precursors (β-primeverosides: 6-O-β-D-xylopyranosyl-β-D-glucopyranosides) in tea leaves.     

(S)-Linalyl, 2-Phenylethyl,and Benzyl Disaccharide Glycosides Isolated as Aroma Precursors from Oolong Tea Leaves

Three glycosides, 6-O-β-d-xylopyranosyl-β-d-glucopyranosides (β-primeverosides) of the aroma constituents, linalool, 2-phenylethanol, and benzyl alcohol, were isolated as aroma precursors from the tea leaves (Camellia sinensis var. sinensis cv. Shuixian and Maoxie, cultivars for oolong tea). The isolation was guided by acid or enzymatic hydrolysis, and subsequent GC and GC-MS analyses. The linalyl glycoside is the first example of naturally occurring (S)-linalyl β-primeveroside.     

Expression of the ginseng PgPR10-1 in Arabidopsis confers resistance against fungal and bacterial infection

Korean ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer) consists of nine cultivars from three Jakyung, Chungkyung, and Hwangsook lines. Among three previously identified PR-10 homologs from ginseng (PgPR10-1, PgPR10-2, and PgPR10-3), we found that the exact same sequence of PgPR10-2 exist in all tested nine cultivars. But a deletion and SNP was found in American ginseng (Panax quinquefolius). PR-10 proteins are known to be small and cytosolic, and showed similar three-dimensional structure. Here we show that the heterologous overexpression of PgPR10-1 in Arabidopsis showed enhanced resistance against Pseudomonas syringe, Fusarium oxysporum, and Botrytis cinerea and in-frame tagging with fluorescent protein showed its cytoplasm and nucleus localization. Protein–protein interaction of PgPR10-2 with PgPR10-1, PgPR10-2 and PgPR10-3 suggests that the PgPR10 proteins might form multimeric complexes in different cellular compartments to function in development and in defense-related mechanism. Differential response of PgPR10-1 and PgPR10-2 against different sets of biotic stresses in ginseng plant supports this notion.     

Computational study of conformational changes in human 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme reductase induced by substrate binding

Abstract

The enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR) is mainly involved in the regulation of cholesterol biosynthesis. HMGR catalyses the reduction of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) to mevalonate at the expense of two NADPH molecules in a two-step reversible reaction. In the present study, we constructed a model of human HMGR (hHMGR) to explore the conformational changes of HMGR in complex with HMG-CoA and NADPH. In addition, we analysed the complete sequence of the Flap domain using molecular dynamics (MD) simulations and principal component analysis (PCA). The simulations revealed that the Flap domain plays an important role in catalytic site activation and substrate binding. The apo form of hHMGR remained in an open state, while a substrate-induced closure of the Flap domain was observed for holo hHMGR. Our study also demonstrated that the phosphorylation of Ser872 induces significant conformational changes in the Flap domain that lead to a complete closure of the active site, suggesting three principal conformations for the first stage of hHMGR catalysis. Our results were consistent with previous proposed models for the catalytic mechanism of hHMGR.

Communicated by Ramaswamy H. Sarma     

trans- and cis-Linalool 3,6-Oxide 6-O-β-d-Xylopyranosyl-β-d-glucopyranosides Isolated as Aroma Precursors from Leaves for Oolong Tea

New glycosidic aroma precursors (1 and 2) of the main volatile constituents, trans- and cis-linalool 3,6-oxides (linalool oxides I and II), were isolated from oolong tea leaves (Camellia sinensis var. sinensis cv. Maoxie). The isolation was guided by an enzymatic hydrolysis with acetone powder prepared from fresh tea leaves (cv. Yabukita) followed by GC or GC-MS analyses. Chromatographic purification of hot water extracts of the tea leaves on active charcoal, Amberlite XAD-2, and Sephadex LH-20 columns as well as HPLC gave two new glycosides, trans- and cis-linalool 3,6-oxide 6-O-β-d-xylopyranosyl-β-d-glucopyra-nosides (1 and 2).     

cis- and trans-Linalool 3,7-Oxides and Methyl Salicylate Glycosides and (Z)-3-Hexenyl β-D-Glucopyranoside as Aroma Precursors from Tea Leaves for Oolong Tea

Two new alcoholic aroma precursors, cis- and trans-linalool 3,7-oxides 6-O-β-D-apiofuranosyl-β-D-glucopyranosides (1 and 2), as well as two already known compounds, (Z)-3-hexenyl β-D-glucopyranoside (3) and methyl salicylate 6-O-β-D-xylopyranosyl-β-D-glucopyranoside (β-primeveroside: 4), and another new monoterpendiol glycoside, 8-hydroxygeranyl β-primeveroside (5) have recently been isolated as aroma precursors in tea leaves (Camellia sinensis var. sinensis cv. Maoxie) ready for oolong tea processing.     

茶树苯丙素类/苯环型挥发性物质的生物合成和胁迫响应的研究进展

茶(Camellia sinensis)的挥发性物质不仅会影响茶香的品质,也会在茶树中发挥重要的生态学功能。除了萜类和脂肪酸衍生类挥发性物质外,苯丙素类/苯环型挥发性物质(volatile phenylpropanoids/benzenoids, VPBs)也同样具有这些方面的功能。正因为具有这些功能,茶树中的VPBs也受到了人们越来越多的重视和研究。对近年来茶中一些具代表性VPBs的研究进展进行了综述,包括2-苯乙醇、苯乙醛等VPBs的生物合成及其对光胁迫的响应;1-苯乙醇和苯乙酮的生物合成途径及其对昆虫胁迫的响应;吲哚的生物合成及其在温度和机械损伤胁迫下的响应机制。此外,也探讨了VPBs中一些非传统的生物合成途径,以及这些途径在某些胁迫条件下的响应机制。