百部内生放线菌的分离、分类及次级代谢潜力

【目的】以对叶百部块根为材料分离内生放线菌,并对分离菌株进行分类、抗菌活性和次级代谢产物合成基因研究。【方法】样品经过严格的表面消毒,选用4种培养基分离百部内生放线菌;分离菌株通过形态观察和16S rRNA序列分析进行分类鉴定;采用琼脂移块法测试分离菌株的抗菌活性;通过PCR检测分离菌株的PKS/NPRS和卤化酶基因;使用HPLC-UV/VIS-ESI-MS/MS分析发酵产物。【结果】从6个样品中获得18株内生放线菌,分属链霉菌属(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)和甲基杆菌属(Methylobacterium)。分离菌株绝大部分具有抗菌活性和次级代谢产物合成基因,其中13株对耐药金黄色葡萄球菌和/或绿脓杆菌有拮抗活性,17株具有PKS/NRPS基因,8株菌具有卤化酶基因,且卤化酶阳性代表菌株的发酵产物具有抗细菌活性和卤代化合物特征。【结论】百部作为一种传统中药,其内生放线菌以链霉菌和小单孢菌为主,在次级代谢产物合成方面具有很好的潜力,可作为一类重要微生物资源进行活性产物开发。     

生防菌解淀粉芽孢杆菌 SQ-2 全基因组测序及生物信息学分析

【背景】解淀粉芽孢杆菌SQ-2是从市售豆瓣酱中分离得到的一株益生菌,实验表明菌株SQ-2具有较强的抑制植物病原真菌的能力,说明SQ-2具有较好的生物防治能力,有作为生物农药的潜力。【目的】研究菌株SQ-2的遗传信息并揭示其抑菌机制。【方法】在Illumina MiSeq X10平台上对菌株SQ-2进行全基因组测序,使用Trim Galore V.0.4.0清理原始数据,并使用FastQC检查质量;使用SOAPdenovo2进行从头组装,使用antiSMASH鉴定负责次级代谢产物生物合成的基因。【结果】解淀粉芽孢杆菌SQ-2基因组大小为3 486 537 bp,GC含量为46.63%,共编码4298个基因,共发现11个与次级代谢产物生物合成相关的基因簇,其中6个被确定为抗真菌物质合成簇,分别编码bacillaene、bacilysin、butirosin、fengycin、bacillibactin和surfactin。基因组框架测序数据提交至NCBI获得GenBank登录号为JAHXSB000000000。超高液相色谱/质谱联用分析表明产生了儿茶酚型嗜铁素、多烯类和表面活性肽。【结论】...     

多粘菌素耐药性的研究进展

多粘菌素因在多重耐药革兰氏阴性菌上的治疗效果良好,再度被应用于临床,其耐药水平在多种抗菌药中曾一度较低,但目前有研究表明多粘菌素的耐药率有增加趋势。作为抗击多重耐药革兰氏阴性菌的最后一道防线,如何抑制其耐药的发生就显得尤为重要。本文就多粘菌素的耐药性现状、产生机制及防控措施三个方面进行了综述,为指导临床科学合理使用多粘菌素及革兰氏阴性菌耐药菌株传播和蔓延的防控措施提供理论依据。     

解淀粉芽孢杆菌SWB16菌株脂肽类代谢产物对球孢白僵菌的拮抗作用

【目的】筛选对球孢白僵菌(Beauveria bassiana)具有较强拮抗作用的细菌菌株及检测菌株脂肽类代谢产物的拮抗活性。【方法】通过形态学观察、生理生化实验、16S rRNA和gyrA基因序列分析鉴定目标菌株;用滤纸片扩撒法(K-B法)测定抑菌圈的直径;采用甲醇萃取菌株发酵液以提取脂肽类代谢产物,并显微观察提取物对白僵菌分生孢子及菌丝的拮抗作用;高效液相色谱-质谱联用方法及靶基因克隆技术检测菌株脂肽类代谢产物的主要成分和基因。【结果】从植物盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis C.H.Wright)组织内分离得到了一株对球孢白僵菌具有较强拮抗活性的菌株SWB16,该菌株属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其脂肽类提取物对球孢白僵菌分生孢子的发芽和菌丝生长均具有明显的抑制作用,质谱检测表明提取物的主要成分是芬枯草菌素和伊枯草菌素,从菌株基因组中克隆到编码芬枯草菌素和伊枯草菌素的fenB基因和ituA基因。【结论】解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)SWB16菌株能产生脂肽类抗生素并对球孢白僵菌具有拮抗作用,拮抗活性显示该菌株对防治家蚕等经济昆虫的白僵病具有潜在的应用价值。     

一株海洋链霉菌MMHS020的抗菌活性代谢产物

【背景】海洋微生物因其生存环境的多样性与独特性,已成为天然产物研究的重要来源。【目的】以一株太平洋海泥来源链霉菌MMHS020为出发菌株,筛选可促进其产生丰富代谢产物的发酵条件,挖掘菌株在抗菌抗肿瘤方面的潜力。【方法】采用单菌株多次级代谢产物策略对MMHS020菌株进行培养诱导,使其产生更丰富的活性代谢产物。双层平板法测定发酵产物对6种指示菌的抑菌活性。以硅胶柱层析、葡聚糖凝胶层析和制备层析等方法对代谢产物进行分离纯化,再通过质谱技术和~1H-NMR和~(13)C-NMR对化合物进行结构解析。【结果】链霉菌属MMHS020菌株可在较高浓度盐离子环境中产生丰富的抑菌活性代谢产物,显示出对枯草芽孢杆菌、结核分枝杆菌和藤黄微球菌等多种指示菌的抑制活性。从发酵产物中分离鉴定了3个化合物,分别是诺卡胺素(1)、麦角甾醇(2)和星形孢菌素(3)。其中星形孢菌素表现出白色念珠菌的抑制活性,而诺卡胺素则对其他几个指示菌表现出较强的抑制活性。【结论】海洋链霉菌MMHS020菌株可代谢产生丰富多样的生物活性物质,具有开发成为新型抑菌生物制剂的潜力。     

2株小双孢菌新种的全基因组测序分析与抗菌活性测定

【背景】抗生素的滥用导致了耐药病原菌的不断增加和扩散,成为威胁人们健康的一个重要因素,因此挖掘新型抗生素显得尤其重要。新的物种很有可能会产生新的生物活性物质,特别是那些常规分离方法很少分离到的稀有放线菌。【目的】对2株小双孢菌潜在新种进行全基因组测序分析与抗菌活性测定,从多层次分子水平鉴定其新种分类地位,并预测次级代谢基因簇,为发现产生新颖活性物质的药用放线菌资源奠定基础。【方法】通过16S rRNA基因序列分析初步确定菌株H10836和H11081的种属分类;采用Illumina平台对2个菌株进行全基因组测序和注释,基于此构建全基因组系统发育树、计算ANI (Average Nucleotide Identity)和dDDH (Digital DNA-DNA Hybridization)值,最终确定菌株的新种分类地位;基于全基因组注释结果进行COG (Clusters of Orthologous Genes)聚类、KEGG (Koyto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路和antiSMASH次级代谢基因簇预测分析;采用琼脂打孔法进行抗菌活性测定。【结果】菌株H10836和H11081与小双孢菌属8个种两两之间的ANI值范围分别为85.3%-92.1%和85.2%-92.1%,dDDH值范围分别为33.0%-44.5%和31.3%-44.5%。ANI和dDDH值均低于物种判断的临界值,而且2株菌在全基因组系统发育树上与小双孢菌属聚成一簇,但独立成一亚支,从分子水平上综合确定菌株H10836和H11081是小双孢菌属的2个潜在新种。antiSMASH分析发现该2株菌基因组中有多种次级代谢产物合成基因簇,而且与已知抗生素合成基因簇相似度较低。抗菌活性测定显示该2株菌代谢产物均有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性。【结论】菌株H10836和H11081是具有抗菌活性的新菌种,因此值得挖掘其新颖活性天然产物,试验结果将为菌株的进一步研究和应用提供参考。     

一株花椒根腐病拮抗菌的分离鉴定及全基因组序列分析

【背景】花椒根腐病的防治一直是生产中难以解决的问题,优良生防菌的筛选是微生物菌剂研发的重要方向。【目的】解析花椒根腐病拮抗菌T-1的遗传信息,深入挖掘其拮抗基因簇资源,揭示该菌的拮抗机制。【方法】采用平板对峙法、形态观察、生理生化测定结合分子生物学等方法进行拮抗菌的分离鉴定,同时对菌株进行全基因组测序,并对其序列进行分析及比较基因组学分析。【结果】分离获得的菌株经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌,编号T-1,该菌对花椒根腐病的抑制率可达72%,可使菌丝前端的生长严重受阻,抑菌谱检测和花椒根片的离体拮抗试验结果表明,拮抗菌T-1具有较广的抑菌活性且离体状态下对花椒根片具有一定的拮抗作用。其全基因组序列数据提交到NCBI的SRA数据库中获得登录号为SRX11086663,基因组总长为3 886 726 bp,GC含量为46.42%,全基因组中有4015个编码基因,占总基因组的89.74%,比较基因组学分析结果显示,菌株T-1与贝莱斯芽孢杆菌模式菌株FZB42相似性高,拮抗基因簇预测结果发现B. velezensis T-1基因组序列中有12个编码次级代谢产物基因合成簇,其中8个与已知功能基因簇高度相似...     

菌株YN145对稻瘟病菌黑色素合成的影响及全基因组分析

【背景】枯草芽孢杆菌YN145是一株从湖南省桃江县的健康稻株中分离的细菌,前期研究中该菌对稻瘟病菌拮抗效果显著,在生物防治方面有很大的应用潜力。【目的】深入研究该菌株的生防机制并挖掘次级代谢产物基因资源。【方法】在4株稻瘟病菌生防菌中,选择其胞外抗菌物质抑制稻瘟病菌黑色素合成效果最佳的菌株YN145,采用紫外-可见分光光度计在波长400 nm处测定胞外和菌丝体内黑色素液的吸光度值,采用菌丝生长抑制平板法和分生孢子萌发抑制法测定抑菌活性。采用PacBio第三代测序和IlluminaHiSeq第二代测序相结合的技术对菌株YN145进行全基因组测序,并对测序数据进行组装,注释预测基因的功能,分析次级代谢产物合成基因簇。【结果】菌株YN145的胞外抗菌物质能较好地抑制稻瘟病菌黑色素合成、分生孢子萌发和菌丝生长。菌株YN145全基因组大小为4 167 871 bp,GC含量为43.86%,编码序列(coding sequence, CDS)数量为4 294个;共找到85个tRNA、30个rRNA和92个sRNA。同时预测到5个已知的次级代谢产物合成基因簇,分别编码合成bacillaene、bac...     

西沙石珊瑚共附生放线菌的分离培养及抗菌活性评价

【背景】珊瑚礁生态系统是海洋中一类极其重要的生态系统,健康珊瑚礁中丰富的共附生放线菌群体是珊瑚抵御各种致病菌的重要防线,因此,这类放线菌是寻找抗菌活性分子的重要资源,其药用潜力巨大。【目的】从西沙石珊瑚样品中分离共附生放线菌,并从中筛选具有良好抗菌活性的菌株。【方法】通过稀释涂布法分离珊瑚共附生放线菌,并根据16S rRNA基因序列构建系统发育树进行菌种鉴定;通过平板对峙法对放线菌进行抗菌活性筛选并确定目标菌株;将目标菌株涂布于不同氯化钠浓度的ISP2固体培养基上培养,测试其盐度耐受能力;通过平板对峙法对该菌株发酵产物的热稳定性和光稳定性进行测试;采用NanoPore和Illumina方法完成目标活性放线菌全基因组测序,并通过antiSMASH在线分析预测其次级代谢产物生物合成基因簇及其结构类型。【结果】从6份西沙石珊瑚样品中分离得到104株可培养放线菌,根据菌落形态和分离来源去重后对其中27株放线菌进行16S rRNA基因序列测序,通过序列比对和系统发育树分析将菌株初步鉴定为盐孢菌属(Salinispora)(25株)、链霉菌属(Streptomyces)(1株)和戈登菌属(Gord...     

一株西瓜枯萎病生防菌Bacillus methylotrophicus的筛选、鉴定及抑菌物质分析

【背景】西瓜专化型尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. niveum, Fon)是西瓜枯萎病的致病菌,严重威胁连作西瓜的生产。【目的】筛选拮抗西瓜枯萎病菌的菌株并推测其无菌上清液(cell-free supernatant, CFS)的抑菌成分,为其在农业生产中的应用提供理论依据。【方法】利用平板对峙法筛选拮抗Fon的菌株,通过盆栽试验验证其抑制西瓜枯萎病的能力,并通过扫描电镜、共聚焦显微镜观察和抗氧化酶活性测定等方法研究Fon暴露在拮抗菌株次级代谢物下孢子形态的变化、膜的完整性和造成的氧化损伤,通过二代Illumina HiSeq联合三代PacBio Sequel测序平台进行全基因组测序、LC-MS非靶代谢组学、超高液相色谱系统和高分辨率质谱(UHPLC-ESI-MS/MS),明确拮抗菌株次级代谢物中的抑菌功能物质。【结果】从健康西瓜根际土筛选到拮抗Fon的一株优良菌株J4,盆栽试验表明其对西瓜枯萎病的防治效果为72.6%。经全基因组学鉴定为Bacillus methylotrophicus J4,该菌株可产蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶和纤维素酶并有分泌铁载体的...     

金黄色葡萄球菌拮抗菌株的筛选鉴定及其抗菌物质分析

【背景】植物内生菌的次生代谢产物是新型天然活性物质的重要来源。【目的】从芍药内生细菌中筛选对金黄色葡萄球菌有抑菌活性的菌株和次生代谢产物。【方法】采用平板对峙法筛选拮抗菌株,根据形态学特征和分子生物学的方法鉴定菌株,PCR扩增检测合成脂肽类物质的功能基因;运用牛津杯法依次测定内生细菌发酵液和脂肽类粗提物的抑菌活性,利用Sephadex LH-20凝胶层析分离脂肽类物质,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析具有抑菌作用的分离组分。【结果】共筛选出13株对金黄色葡萄球菌具有不同程度抑制作用的内生菌株,其中菌株SY11的抑菌作用最为显著,其发酵液和脂肽类粗提物均具有较强的抑制作用。结合形态学鉴定以及16S r RNA基因序列分析,鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。PCR扩增检测表明菌株SY11含有3个合成脂肽类物质的功能基因fenA、ituD和srfkn,推测该菌株可能具有合成脂肽类物质的能力。根据具有抑菌活性分离组分的质谱分析结果,推测其有效物质的主要成分为Bacillomycin D。【结论】解淀粉芽孢杆菌SY11对金黄色葡萄球菌有良好抑制效果,其脂肽类粗提物也具有较强的体外抑菌活性。本研究为芍药内生细菌的开发应用奠定了基础。     

Antifungal and antibacterial activities of indigenous <Emphasis Type="Italic">Streptomyces</Emphasis> isolates from saline farmlands: prescreening,ribotyping and metabolic diversity

A culture collection of 110 indigenous Streptomyces strains originally isolated from saline farmlands (Punjab, Pakistan) using stringent methods was screened biologically and chemically to investigate their potential for the production of bioactive secondary metabolites. In a biological screening the crude extracts obtained from the culture broth of selected strains were analysed for their activity against a set of test organisms, including Gram-positive, Gram-negative bacteria, fungi and microalgae using the disk diffusion bioassay method. Additionally a cytotoxicity test was performed by means of the brine shrimp microwell cytotoxicity assay. In a chemical screening each of the crude extracts was analysed by TLC using various staining reagents and by HPLC-MS/MS measurements. The results depicted an impressive chemical diversity of crude extracts produced by these strains. The taxonomic status of the selected strains was confirmed by preliminary physiological testing and 16S rRNA gene sequencing.     

Antibacterial and antilarval activity of deep-sea bacteria from sediments of the West Pacific Ocean

Deep-sea microorganisms are a new source of bioactive compounds. In this study, crude ethyl acetate extracts of 176 strains of deep-sea bacteria, isolated from sediments of the West Pacific Ocean, were screened for their antibacterial activity against four test bacterial strains isolated from marine biofilms. Of these, 28 deep-sea bacterial strains exhibited antibacterial activity against one or more of the bacteria tested. Active deep-sea bacterial strains belonged mainly to the genera of Pseudomonas, Psychrobacter and Halomonas. Additionally, antilarval activity of 56 deep-sea bacterial strains was screened using Balanus amphitrite larvae. Seven bacterial strains produced metabolites that had strong inhibitive effects on larval settlement. None of these metabolites showed significant toxicity. The crude extract of one deep-sea Streptomyces strain could completely inhibit larval settlement at a concentration of 25 microg ml(-1).     

具抑菌活性连翘内生真菌的分离与鉴定

【目的】从药用植物连翘内生真菌中筛选抑菌活性菌株, 并对其主要活性成分进行检测分析。【方法】采用常规组织分离法分离内生真菌, 滤纸片法测定其发酵产物对3种指示细菌的抑菌活性。TLC、HPLC和HPLC-MS检测活性菌株代谢产物中连翘苷成分。根据形态学特征和ITS序列分析鉴定目的菌株。【结果】分离得到的24株内生真菌中抑菌圈直径超过10 mm的菌株, 发酵液组有11株(45.8%), 菌丝体组有19株(79.2%), 活性菌株主要集中在果实内生真菌中, 其中G5、G7和G10表现出较强的抑菌活性。从菌株G10的胞内产物中发现活性成分连翘苷, 将其鉴定为胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides。【结论】连翘内生真菌是天然抗菌活性物质的重要筛选来源。     

Antibacterial and antilarval activity of deep-sea bacteria from sediments of the West Pacific Ocean

Abstract

Deep-sea microorganisms are a new source of bioactive compounds. In this study, crude ethyl acetate extracts of 176 strains of deep-sea bacteria, isolated from sediments of the West Pacific Ocean, were screened for their antibacterial activity against four test bacterial strains isolated from marine biofilms. Of these, 28 deep-sea bacterial strains exhibited antibacterial activity against one or more of the bacteria tested. Active deep-sea bacterial strains belonged mainly to the genera of Pseudomonas, Psychrobacter and Halomonas. Additionally, antilarval activity of 56 deep-sea bacterial strains was screened using Balanus amphitrite larvae. Seven bacterial strains produced metabolites that had strong inhibitive effects on larval settlement. None of these metabolites showed significant toxicity. The crude extract of one deep-sea Streptomyces strain could completely inhibit larval settlement at a concentration of 25 μg ml^?1.     

银杏内生细菌的分离鉴定及抑菌活性初探

【目的】从银杏(Ginkgo biloba)茎叶中分离鉴定内生细菌, 测定其体外抑菌活性及对辣椒果疫病的防治效果。【方法】采用平板对峙法筛选出对辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)有拮抗作用的内生细菌, 并用平板对扣法测定其中一株防治效果较好的内生细菌产生的挥发性物质对辣椒疫霉菌生长的影响。通过生防菌液和病原菌孢子悬浮液喷雾接种辣椒果测定该菌株对辣椒果疫病的防治效果。基于形态特征、生理生化特性、16S rDNA和gyrA基因序列同源性分析鉴定该生防菌株。【结果】从银杏的茎和叶中分离获得9株内生细菌。平板对峙生长试验结果表明, 菌株W5对供试的辣椒疫霉菌、稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、水稻纹枯菌(Rhizoctonia solani)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、荔枝霜疫霉菌(Peronophythora litchi)、荔枝酸腐菌(Geotrichum candidum)均有抑制作用, 其中对辣椒疫霉菌、稻瘟病菌和荔枝霜疫霉菌的抑菌效果显著, 抑菌率分别为88.9%、86.3%和90.2%。其产生的挥发性物质能明显抑制辣椒疫霉菌菌丝的生长。对辣椒采后果疫病的防治效果表明, 先喷雾接种W5菌悬液24 h后再接种辣椒疫霉病菌孢子悬浮液的防治效果最好, 可将辣椒果的保鲜期延长2?3 d。该菌株被鉴定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。【结论】获得了一株对植物病原菌物有良好防治效果的银杏内生解淀粉芽胞杆菌W5, 对辣椒采后果疫病及其他病原真菌的防治具有潜在应用价值。     

具有抗哈维氏弧菌活性共生真菌HLZ-3菌株的筛选、鉴定及其培养条件

【背景】目前,海水养殖业中主要利用抗生素来防治哈维氏弧菌等病原菌,但抗生素的长期使用或滥用会对环境和人体健康带来危害,因此既环保又有效的生物防治方法具有广阔的应用前景。【目的】从海水产品共生微生物中筛选具有抗菌活性的菌株,对活性菌株进行鉴定并确定其合成抗菌活性物质的培养条件。【方法】利用沙氏和2216E培养基,以稀释涂布平板法从海水养殖动物中分离真菌和细菌;利用牛津杯法测定微生物发酵液抗水产病原哈维氏弧菌的活性;通过菌株的培养特征、形态特征和ITS序列分析对抗菌活性菌株进行鉴定;通过筛选发酵培养基的种类及盐度确定培养条件。【结果】从海蚌、白虾、海蛎子等9种样品中分离出微生物52株,其中真菌30株、细菌22株;筛选得到2株具有抗哈维氏弧菌活性的真菌菌株;其中一株活性菌株HLZ-3被鉴定为塔宾曲霉;菌株HLZ-3合成抗菌活性物质的培养条件为4%NaCl的大米培养基,28°C静置培养2周。【结论】实验结果为进一步分离纯化菌株HLZ-3所产抗菌活性次生代谢产物提供了基础。     

Antimicrobial activity in sub-Arctic marine invertebrates

In the marine environment, any living or non-living surface is exposed to bacterial colonization. Many invertebrate species in temperate, tropical and Antarctic regions have demonstrated chemical defences against the formation of microbial films. In the present study, the antimicrobial activity of sub-Arctic invertebrates was investigated for the first time. Crude extracts of abundant invertebrates belonging to several taxonomic groups were tested for their inhibitory effects on the growth of five sympatric phylogenetically diverse bacterial strains. Six out of 18 (33%) crude extracts inhibited bacterial growth at natural extract concentrations. The crude extract of the sponge Haliclona viscosa inhibited growth of all five bacterial strains, suggesting the presence of metabolites with broad-spectrum activity. Three active compounds were isolated from H. viscosa having antibacterial properties similar to those of the crude extract. Our data indicate that antibacterial secondary metabolites are present in sub-Arctic marine invertebrates but are less abundant than in temperate, tropical or Antarctic species.     

西沙海藻共附生放线菌的分离鉴定及其抗菌活性评价

【目的】为了探究南海海藻共附生放线菌资源的多样性及潜在的应用价值,对中国西沙群岛来源的海藻进行共附生放线菌的分离鉴定与抗菌活性筛选。【方法】利用稀释涂布平板法,采用2种不同分离培养基对不同采样位点的6种海藻进行放线菌分离;通过16S rRNA基因序列分析、构建系统发育树对分离的放线菌进行鉴定;用打孔法对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)等10种敏感细菌进行抗菌活性筛选;对筛选得到的目标活性菌株HZ014进行全基因组测序,通过AntiSMASH在线工具分析其次级代谢产物生物合成基因簇,预测其产生新型活性物质的潜力。【结果】从6种海藻中分离得到36株共附生放线菌,基于16S rRNA基因序列比对和系统发育分析,鉴定结果为链霉菌属(Streptomyces) 2株、红球菌属(Rhodococcus) 2株、诺卡氏菌属(Nocardia)3株、小单孢菌属(Micromonospora) 5株和盐孢菌属(Salinispora) 24株;抗菌活性筛选结果表明,36株共附生放线菌发酵粗提物对至少1种敏感细菌表现出一定的抑制作用,不同菌株发酵粗提物的抗菌活性存在明显差异,...