蝙蝠蛾幼虫肠道真菌复合体中的多菌种与中国被毛孢分生孢子联合侵染蝙蝠蛾幼虫提高侵染效能

应用真菌特异性引物PCR测序、克隆测序和SNP质谱基因分型法,鉴定2株蝙蝠蛾幼虫活体肠道的真菌分离株(CH1和CH2)中的多种菌物。应用这2株分离株与中国被毛孢分生孢子联合侵染蝙蝠蛾幼虫,观察其协同侵染活性。结果表明这2株分离株呈现中国被毛孢的体外培养生长和显微形态特征。通用引物ITS4/5和蝙蝠蛾拟青霉特异性引物Pp4/5扩增子测序检出蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢ITS序列。扩增子克隆-测序和SNP基因分型法证实多种转换和颠换点突变基因型在2株分离株中共存。反复固体、液体培养证实蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢ITS序列共存,并非真菌间DNA片段漂移。应用子囊孢子或中国被毛孢侵染4~5龄蝙蝠蛾幼虫,幼虫染菌率为1.37%~3.52%,幼虫变僵时间为35~50 d。应用2株分离株与中国被毛孢分生孢子联合侵染,幼虫变僵时间为5~8 d,染菌率达55.2%(P0.001),侵染效能提高15~39倍。蝙蝠蛾拟青霉和多种点突变基因型冬虫夏草菌(包括中国被毛孢)在蝙蝠蛾幼虫肠道以天然真菌复合体形式共存;多种菌物组成的侵染源联合侵染蝙蝠蛾幼虫大幅度提高侵染效能,呈现多菌协同侵染的共生关系。     

冬虫夏草成熟过程中中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉DNA共存及竞争增殖力、化学成分变化

文献报道从冬虫夏草中分离得到蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢,本研究检测了蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢真菌及其DNA在冬虫夏草中的共存,同时检测了2个真菌在冬虫夏草成熟过程中的竞争增殖力。应用色谱法和质谱法检测了冬虫夏草及中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的化学成分指纹谱。在冬虫夏草中检测到蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢活菌,在虫体和子座中检测到这两个真菌的DNA。从子座露出地表后,冬虫夏草的成熟伴有蛋白质和小分子有机化合物指纹谱的动态变化,中国被毛孢竞争增殖力下降(P<0.001)。中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的化学成分指纹谱均不能与冬虫夏草的成分完全重叠,与中国被毛孢相比,蝙蝠蛾拟青霉菌丝体与冬虫夏草的指纹谱更相似。结论:中药冬虫夏草的成熟伴有蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢真菌共存于它的虫体和子座,也伴有冬虫夏草化学成分的变化和中国被毛孢竞争增殖力的下降。     

中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉小鼠免疫功能调节作用的比较

目的观察中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉对小鼠免疫功能的影响。方法分别给予中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉后,测定观察对小鼠碳粒廓清功能、迟发性变态反应、溶血素抗体、淋巴细胞增殖和NK细胞活性等的影响。结果3．0g／kg中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉可显著提高小鼠吞噬指数和半数溶血值（P〈0．01）、显著提高T、B淋巴细胞增殖能力（P〈0．01,P〈0．05）、显著提高NK细胞活性（P〈0．05）,0．5～1．5g／kg中国被毛孢都能显著抑制小鼠耳廓肿胀（P〈0．01,P〈0．05）,同时还能抑制脾脏和胸腺增大（P〈0．01,P〈0．05）。结论中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉均具有免疫调节作用,而中国被毛孢免疫抑制及增强天然免疫系统作用要优于蝙蝠蛾拟青霉,而对适应性免疫系统增强作用蝙蝠蛾拟青霉优于中国被毛孢。     

冬虫夏草成熟过程中冬虫夏草菌及其突变基因型在子座和僵虫体中的差异表达

文献报道了从冬虫夏草(Cs)中同时检出蝙蝠蛾拟青霉(Ph)、中华被毛孢(Hs)和冬虫夏草菌(Os)的多个基因型;Cs的成熟伴有化学成分的改变和僵虫体中Hs竞争性菌落形成能力的下降.同时检验了Cs成熟过程中Os突变基因型生物量的变化.应用Southern杂交检验发现:Cs的成熟伴有Ph和2组Os基因型生物量的显著增加.o...     

冬虫夏草的微循环产孢及其无性型的分离

从采自云南德钦白马雪山的冬虫夏草子实体上,利用改进的子囊孢子弹射法获得其无性型中国被毛孢,并利用冬虫夏草子囊孢子的微循环产孢和无性型菌丝的载片培养,证明我们获得纯培养是冬虫夏草的无性型。     

冬虫夏草寄主昆虫选育及生殖退化研究

选育发育速度快、繁殖能力强、中国被毛孢侵染率和冬虫夏草产出率高的寄主昆虫品系是冬虫夏草培植的基础,同时明确冬虫夏草的寄主昆虫蝙蝠蛾退化机制是保证冬虫夏草培植的条件。本文从冬虫夏草产区采集蝙蝠蛾种群种质资源,分别针对蝙蝠蛾发育速度、繁殖能力、中国被毛孢侵染率、冬虫夏草产出率4个方面通过杂交及四代选育,获得新种群（A1）,该种群对冬虫夏草繁育环境的适应力强,发育整齐度高,繁育一代的种群扩繁倍数从8.2倍提高至26.3倍;对中国被毛孢的敏感性较好,侵染率高,冬虫夏草产出率从原始种群的11.2%提高至18.5%。同时,仿照高原生态环境长期饲养冬虫夏草的寄主昆虫蝙蝠蛾,其子代出现雌雄比失调、发育历期分化、生殖力降低等退化现象。经过研究分析得知卵孵化率下降的主要原因是雄性的生殖力下降。组织切片观察蝙蝠蛾雄性生殖系统,在幼虫后期、蛹、成虫期会出现生精囊减少及畸形等异常情况,推测此为雄性生殖力降低、卵孵化率下降的生理原因。研究结果为高效、稳定地饲养蝙蝠蛾保证冬虫夏草培植具有重要意义。     

冬虫夏草的微循环产孢及其无性型的分离*

从采自云南德钦白马雪山的冬虫夏草子实体上,利用改进的子囊孢子弹射法获得其无性型中国被毛孢,并利用冬虫夏草子囊孢子的微循环产孢和无性型菌丝的载片培养,证明我们获得纯培养是冬虫夏草的无性型。     

西藏冬虫夏草无性型的分子生物学研究

从西藏采集的冬虫夏草子实体中分离出 3个菌株C3、C4、C5,通过培养特征的研究以及采用分子生物学方法 ,以rDNAITS区为分子指标 ,与冬虫夏草 [Cordycepssinensis(Berk .)Sacc.) ]的有性世代及中国被毛孢 (HirsutellasinensisLiu ,Guo,Yu&Zeng)进行比较分析 ,发现C4的培养特征与C3、C5 完全不同 ,其序列与冬虫夏草的相似率为 93 %,与中国被毛孢的相似率为 94%,而C3、C5 与冬虫夏草的相似率很低 (分别为 5 5 %和 6 9%) ,从而证明C4是西藏冬虫夏草的无性型 ,为中国被毛孢。     

确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据：Ⅰ.中国被毛孢与冬虫夏草之间 …

从青海的冬虫夏草子实体上分离出中国被毛孢「Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋ．）Ｓａｃｃ．」,并利用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术,筛选出８种引物,获得了冬虫夏草和中国被毛孢相应的基因组ＤＮＡ指纹图谱,两者相似率高达９６％,从而表明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢。     

针对性rDNA-ITS序列分析不支持冬虫夏草复合种假设

冬虫夏草是有名的中药材,作为滋补药物已有数百年历史。它主要分布于亚洲高纬度草甸地带,寄主为蝙蝠蛾幼虫。目前有许多证据尤其是在rDNA-ITS水平上支持中国被毛孢Hirsutella sinensis是冬虫夏草的唯一无性型。然而,除了那些属于明显的错误注册的序列以外,从NCBI数据库检索得到的多个已注册为"冬虫夏草"的序列彼此之间的差异十分显著。基于这些有差异的GenBank序列,有些作者提出了冬虫夏草种复合群体及其包含的三个隐存种的假设。为检验该假设,我们以单株冬虫夏草子实体为材料,开展了rDNA-ITS序列分析研究。冬虫夏草样品分别采自中国的四川和青海两省。结果显示只有‘冬虫夏草A组’应为真正的冬虫夏草,而B组和C组很有可能属于其他真菌,而非冬虫夏草的隐存种。     

Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.8S rDNA

The anamorph determination of Cordyceps sinensis remains problematic due to the lack of clear links between the sexual and conidial forms of the fungus. In this study, we applied molecular approaches to analyze the genetic variation of Cordyceps sinensis and its allies to identify the anamorph-teleomorph connection. The sequences of the internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) and 5.8S ribosomal RNA gene of Cordyceps sinensis (teleomorph) collected from Qingzang plateau (altitude over 4000m), Tibet and several related asexual conidial forms were determined. The sequence comparison showed that Cordyceps sinensis was most closely related to Hirsutella sinensis, and was clearly divergent from Paecilomyces sinensis, Stachybotrys sp. or Tolypocladium sp.; distance values, estimated according to Kimura two-parameter models between Cordyceps sinensis and Hirsutella sinensis, were extremely low (<0.02), whereas distance values between Cordyceps sinensis and Paecilomyces sinensis, Stachybotrys sp. and Tolypocladium sp. were 0.34, 0.21 and 0.25, respectively. Taken together, Hirsutella sinensis and Cordyceps sinensis are the different stages of the life cycle stages of the same organism. Hirsutella sinensis is therefore the anamorph of Cordyceps sinensis, rather than Paecilomyces sinensis or other species. The possible reasons as to why different taxa can be obtained when culturing Cordyceps sinensis are also discussed.     

冬虫夏草无性型研究概况*

文献调查结果表明与冬虫夏草有关的无性型菌种已报道有22个学名,涉及13个属。针对这些名称上存在的命名问题本文展开了讨论,并评述了不同名称与冬虫夏草的关系及其有关菌种的研究进展。在已报道的分离菌种中,作为新种正式描述的名称有8个,其中6个为合格发表,其余2个未能满足名称合格发表的条件;还有4个名称在文献中作为新种提到,但没有合格发表的出处,也有一例只提到名称而无其他要素;另有5个名称则只有属名,尚未鉴定到种的水平。中国被毛孢为多个独立的研究证明为冬虫夏草的无性型,还有3个无性型名称已被证明不可能是冬虫夏草的无性型。其他无性型名称与冬虫夏草的关系有待进一步验证。文中对与冬虫夏草有关的菌种定名、无性型分离和验证方法、复无性型现象,以及有关学名问题作了讨论。     

虫草属分子系统学研究现状

近年来的分子系统学研究结果表明 ,麦角菌目 (Clavicipitales)与肉座菌目 (Hypocreales)以及虫草属[Cordyceps(Fr.)Link]与麦角菌科 (Clavicipitaceae)内的有关种属关系密切 ,但虫草属为一多系群 ,其中只有新虫草亚属的种类形成单系群。虫草属种类的进化与寄主有一定的关系 ,有关研究显示它们在亲缘关系相差很大的寄主之间多次转移。多个独立的ITS序列研究表明 ,阔孢虫草 (CordycepscrassisporaM .Zangetal.)、甘肃虫草(CordycepsgansuensisK .Y .Zhangetal.)、多轴虫草 (CordycepsmultiaxialisM .Zang&Kinjo)、尼泊尔虫草 (CordycepsnepalensisM .Zang&Kinjo)与冬虫夏草 [Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.]为同一物种 ;RAPD和ITS序列分析还显示不同地理分布的冬虫夏草存在明显的遗传分化。分子生物学方法在确定有性型与无性型的关系上已经为多种虫草菌提供了有力的证据。本文主要对虫草属分子系统学研究现状进行了综述 ,同时就分子生物学研究中的取样问题、一些分子方法的适用范围以及有性型与无性型的关系等问题进行了讨论。     

确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据I.中国被毛孢与冬虫夏草之间的关系

从青海的冬虫夏草子实体上分离出中国被毛孢［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋ．）Ｓａｃｃ．］,并利用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术,筛选出８种引物,获得了冬虫夏草和中国被毛抱相应的基因组ＤＮＡ指纹图谱,两者相似率高达９６％,从而表明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢。     

虫草及其无性型中的抗肿瘤细胞活性成分

较系统地总结了目前在虫草及其无性型中发现的抗肿瘤细胞活性成分.其中冬虫夏草、蛹虫草、大团囊虫草、单侧虫草、戴氏虫草和拟蛹虫草等虫草以及它们的无性型蛹拟青霉、细脚拟青霉、金龟子绿僵菌和球孢白僵菌等虫生真菌代谢物中抗肿瘤细胞活性成分,其结构包括多糖类、甾醇类、含氮化合物和杂环化合物等多个类型.