ΦC31整合酶与转基因动物研制

链霉菌噬菌体 C31整合酶是一种位点性特异重组酶。它以单向整合方式进行重组,无须其他辅助因子,且整合效率高、表达稳定,所以近年来越来越多地被用来介导外源基因与宿主基因组的特异性整合,并被应用于哺乳动物的转基因整合技术中,它为攻克转基因动物研制过程中的随机整合、整合效率低、表达水平不高等技术瓶颈提供了新思路。本文将对链霉菌噬菌体 C31整合酶的作用机制和特点优势作简要的阐述,并对其广阔的应用前景作一展望。     

φC31整合酶系统介导的位点特异性整合研究进展

来源于链霉菌(Streptomyces)噬菌体φC31的整合酶可介导链霉菌附着位点(attB)和噬菌体附着位点(attP)之间的同源重组,这种重组亦可在多种动植物细胞内进行;而且,该整合酶还可介导含attB位点的载体以位点特异性方式整合于多种真核生物基因组内的假attP位点,并使转基因持续高效表达。因此,φC31整合酶在基因修饰、基因治疗及转基因动物研制等方面得到了广泛的应用。文章就近年来φC31整合酶整合规律、提高效率方面的改进及安全性等相关领域的研究进展进行了综述。     

卵母细胞特异表达φC31整合酶载体pZP3-INT的构建及其在小鼠卵母细胞中的表达

链霉菌噬菌体φC31整合酶是一种位点特异性重组酶(Site-specific recombinase,SSR),可介导链霉菌噬菌体attP位点(Phage attachment site)和链霉菌基因组attB位点(Bacterial attachment site)间的单向重组.为探讨它能否应用于卵母细胞特定基因的重组,文章采用卵巢针刺取卵法采集生发泡(GV)期小鼠卵母细胞,将卵透明带糖蛋白3(ZP3)启动子驱动φC31整合酶表达载体pZP3-INT和检测φC31整合酶位点特异性重组功能的重组质粒载体pBCPB+,通过显微注射导入到小鼠卵母细胞中.培养48 h后,RT-PCR检测φC31整合酶mRNA表达以及PCR检测pBCPB+载体发生重组的情况.结果表明:载体pzP3-INT在卵母细胞中表达φC31整合酶mRNA;并且pBCPB+载体发生了位点特异性重组,提示φC31整合酶在卵母细胞中可以介导位点特异性重组反应.     

φC31整合酶与生物医学

来源于链霉菌噬菌体φC31的整合酶可通过介导链霉菌attB序列与多种生物内源性特异性序列产生重组反应,将外源基因定点整合到生物基因组中。在基因治疗研究中应用φC31整合酶,可使外源基因长期高水平表达,从而达到较好的治疗效果;且由于外源基因定点整合,故安全隐患较小。此外,φC31整合酶还可以用来生产外源基因定点整合的转基因动物,在基础研究和应用研究领域都有很高的潜在应用价值。     

高效位点特异性链霉菌φC31噬菌体整合酶的研究进展

链霉菌φC31噬菌体整合酶（φC31-int）属于位点特异性重组酶的解离酶／转化酶系,该家族催化机制由丝氨酸介导,能识别噬菌体附着位点（attP）和宿主基因组上的细菌附着位点（attB）,介导同源序列之间的位点特异性重组。实验证实,φC31-int是一种高效位点特异性整合工具酶,与其他整合策略相比,具有集高效和安全于一体的优点,通过介导位点特异性整合,将外源基因特异地整合到宿主基因组,使目的基因得以持续、高效的表达,并且具有DNA容量方面的优势。随着研究的深入,人们对φC31-int介导整合作用机制和影响因素有了进一步的认识。通过一系列成功应用φC31-int进行的基因治疗的动物学实验,为今后如何利用非病毒载体系统进行基因治疗及转基因动物模型的建立提供了一种新的选择。     

卵母细胞特异表达ФC31整合酶载体pZP3－INT的构建及其在小鼠卵母细胞中的表达

链霉菌噬菌体ФC31整合酶是一种位点特异性重组酶（Site—specific recombinase,SSR）,可介导链霉菌噬菌体attP位点（Phage attachment site）和链霉菌基因组attB位点（Bacterial attachment site）闻的单向重组。为探讨它能否应用于卵母细胞特定基因的重组,文章采用卵巢针刺取卵法呆集生发泡（GV）期小鼠卵母细胞,将卵透明带糖蛋白3（ZP3）启动子驱动的ФC31整合酶表达载体pZP3－INT和检测qbC31整合酶位点特异性重组功能的重组质粒载体pBCPB^＋,通过显微注射导入到小鼠卵母细胞中。培养48h后,RT-PCR检测ФC31整合酶mRNA表达以及PCR检测pBCPB^＋载体发生重组的情况。结果表明：载体pZP3-INT在卵母细胞中表达ФC31整合酶mRNA;并且pBCPB^＋载体发生了位点特异性重组,提示ФC31整合酶在卵母细胞中可以介导位点特异性重组反应。     

一种快捷可靠评价链霉菌噬菌体φC31整合酶功能的双荧光报告系统

在NIH3T3细胞中构建了一种链霉菌噬菌体φC31整合酶报告系统.该报告载体同时编码红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白,与编码φC31整合酶的载体共转染可以反映φC31整合酶的活性.细胞中从红色荧光到绿色荧光的变化和百分比的变化可经流式细胞仪检出.随着转染中φC31整合酶表达载体的比例升高,表达绿色荧光的细胞比例上升.φbC31整合酶表达载体和报告系统载体比例在10:1时,可达最高约90%的红绿荧光转变率.这表明该φC31整合酶报告系统提供了一种在细胞中快捷可靠的评价φ31整合酶功能的方法.     

高效位点特异性链霉菌ψC31噬菌体整合酶的研究进展

链霉菌ψC31噬菌体整合酶(ψC31-int)属于位点特异性重组酶的解离酶/转化酶系,该家族催化机制由丝氨酸介导,能识别噬菌体附着位点(attP)和宿主基因组上的细菌附着位点(attB),介导同源序列之间的位点特异性重组.实验证实,ψC31-int是一种高效位点特异性整合工具酶,与其他整合策略相比,具有集高效和安全于一体的优点,通过介导位点特异性整合,将外源基因特异地整合到宿主基因组,使目的基因得以持续、高效的表达,并且具有DNA容量方面的优势.随着研究的深入,人们对ψC31-int介导整合作用机制和影响因素有了进一步的认识.通过一系列成功应用ψC31-int进行的基因治疗的动物学实验,为今后如何利用非病毒载体系统进行基因治疗及转基因动物模型的建立提供了一种新的选择.     

卵母细胞特异表达fC31整合酶载体pZP3-INT的构建及其在小鼠卵母细胞中的表达

链霉菌噬菌体fC31整合酶是一种位点特异性重组酶(Site-specific recombinase, SSR), 可介导链霉菌噬菌体attP位点(Phage attachment site)和链霉菌基因组attB位点(Bacterial attachment site)间的单向重组。为探讨它能否应用于卵母细胞特定基因的重组, 文章采用卵巢针刺取卵法采集生发泡(GV)期小鼠卵母细胞, 将卵透明带糖蛋白3(ZP3)启动子驱动的fC31整合酶表达载体pZP3-INT和检测fC31整合酶位点特异性重组功能的重组质粒载体pBCPB⁺, 通过显微注射导入到小鼠卵母细胞中。培养48 h后, RT-PCR检测fC31整合酶mRNA表达以及PCR检测pBCPB⁺载体发生重组的情况。结果表明: 载体pZP3-INT在卵母细胞中表达fC31 整合酶mRNA; 并且pBCPB⁺载体发生了位点特异性重组, 提示fC31整合酶在卵母细胞中可以介导位点特异性重组反应。     

位点特异整合微环DNA的体内制备

目的:应用诱导表达的LR克隆酶系统,建立一种在细菌体内获得基于链霉菌噬菌体ФC31整合酶系统的位点特异整合型微环DNA的方法,为实现无细菌骨架等冗余序列的转基因奠定基础。方法:构建包含阿拉伯糖启动子的LR克隆酶系统和ФC31整合酶系统的亲本质粒,在L-阿拉伯糖的诱导下重组产生表达ФC31整合酶的微质粒和包含有目的基因和attB位点等元件的微环DNA。以限制性内切核酸酶酶切电泳定性其重组效率,qPCR定量分析微环、微质粒及亲本质粒的比例,定量计算重组效率。观察随着诱导时间的推进微环/微质粒值的变化。结果:细菌体内LR克隆酶系统可有效催化亲本质粒的重组,重组率达85%以上。相比商品化LR克隆酶体外反应具有更高的稳定性而且更经济。结论:获得了一种高效、稳定的细菌体内产生位点特异性整合型微环DNA的亲本质粒。     

应用接头PCR的方法扩增假attP位点

φC31整合酶可高效介导外源基因特异、稳定地与哺乳动物基因组发生重组反应.基因组中被整合的住点为假attP位点.运用接头PCR的方法对φC31整合酶介导的含有attB序列及表达绿色荧光蛋白(GFP)的载体在牛基因组中的一个新的特异整合位点(假attP位点)进行扩增.并且显示接头PCR技术在克隆与已知序列相邻的未知旁侧序列上其具有高效、特异、灵敏等特点.     

一种快捷可靠评价链霉菌噬菌体ФC31整合酶功能的双荧光报告系统

在NIH3T3细胞中构建了一种链霉菌噬菌体ФC31整合酶报告系统．该报告载体同时编码红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白,与编码ФC31整合酶的载体共转染可以反映ФC31整合酶的活性．细胞中从红色荧光到绿色荧光的变化和百分比的变化可经流式细胞仪检出．随着转染中ФC31整合酶表达载体的比例升高,表达绿色荧光的细胞比例上升．ФC31整合酶表达载体和报告系统载体比例在10∶1时,可达最高约90%的红绿荧光转变率．这表明该ФC31整合酶报告系统提供了一种在细胞中快捷可靠的评价ФC31整合酶功能的方法．     

ΦC31整合酶介导猪基因组定点修饰的探讨

高效与特异的基因组定点修饰是基因工程动物研究的前沿与难点.链霉菌噬菌体ΦC31整合酶能介导含attB位点的外源基因定点整合于多种真核生物基因组的假attP位点,可维持外源基因的正常结构及高效表达.本文探讨ΦC31整合酶介导外源基因在猪基因组内定点整合的分子基础.构建含attB位点的报告载体pEGFP-N1-attB,与ΦC31整合酶表达载体pCMV-INT共转染猪肾PK15细胞,G418筛选获得单克隆细胞系.实时荧光定量PCR筛选出单拷贝整合的转基因细胞系.TAIL-PCR鉴定出1个猪基因组假attP位点,位于猪1号染色体,watson链,坐标114220087-114220126,命名为pig-attP-1.测序结果显示,pEGFP-N1-attB在attB位点处断开插入到pig-attP-1.用荧光计测定细胞培养基上清EGFP含量发现,该转基因细胞系EGFP的表达水平是本底的50倍(13500 AU vs.280 AU),表明pig-attP-1是利于外源基因高效表达的"友好位点".该研究不仅为实现外源基因在猪基因组内的定点整合提供了新策略,也为创制基因工程猪、建立动物生物反应器等研究注入了新思路.     

大肠杆菌-链霉菌穿梭表达载体pMF的构建及其应用

【目的】构建能定点整合到链霉菌(Streptomyces)染色体上的高效表达载体。【方法】以链霉菌自杀型表达载体pLSB2为基础,通过插入链霉菌噬菌体ΦC31整合酶基因int和attP位点(Phage attachment site),构建了能在大肠杆菌和链霉菌之间进行接合转移并定点整合到链霉菌染色体上的表达载体pMF。将pMF转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002),并分别接合转移天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolorM145)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividansTK24)和红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea2338),挑取接合子进行PCR和Southern杂交检测。将来自刺糖多孢菌S08-4的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAM-s)克隆到载体pMF的启动子下游,接合转移到天蓝色链霉菌中。【结果】表明pMF成功整入链霉菌染色体,并且检测到目的蛋白的表达。【结论】构建的pMF载体可作为外源基因定点整合表达的有效工具,为后续的基因功能研究以及链霉菌的遗传改造奠定了基础。     

Daxx与ΦBT1相互作用并抑制其重组活性

噬菌体整合酶ΦBT1因其具有可介导转基因位点特异性整合的能力而成为了基因治疗中一种有效的工具,它丰富了转基因载体的选择,并使得多位点特异性整合成为可能.为了能够更加安全有效地利用ΦBT1整合酶作为基因治疗载体,有必要了解ΦBT1整合酶与宿主细胞内蛋白质相互作用的情况.酵母配对实验与免疫共沉淀实验揭示了ΦBT1整合酶中4个氨基酸433RFAL436对整合酶与PML-NBs蛋白Daxx的结合起到了关键作用.通过进一步构建并利用ΦBT1整合酶哺乳动物细胞报告系统,证实过表达Daxx会抑制ΦBT1整合酶在293T细胞中的重组效率.以上结果表明,细胞内的蛋白质可以与ΦBT1整合酶发生相互作用并抑制其重组活性,对于改善ΦBT1整合酶介导的转基因操作以及选择ΦBT1整合酶靶细胞方面具有重要的参考意义.     

适用于链霉菌大片段基因组DNA 克隆和异源表达的细菌人工染色体(BAC)载体的构建及应用

【目的】很多链霉菌来源的天然产物的生物合成基因簇往往很大,用传统的cosmid载体很难完整的克隆和异源表达。本研究通过载体改造,成功构建出一个新的细菌人工染色体(BAC)载体,用于链霉菌来源的天然产物生物合成基因簇的克隆及异源表达实验。【方法】从复合型载体pCUGIBAC1出发,通过λRED介导的PCR-targeting方法,用链霉素抗性基因替换掉原有的氯霉素抗性基因标记,同时插入链霉菌中常用的安普拉霉素抗性标记、转移起始位点oriT、φC31整合酶基因int、整合位点attP等元件。【结果】成功构建出可装载链霉菌大片段DNA的BAC载体pMSBBACs。使用pMSBBACs构建出链霉菌U27的基因组BAC文库,平均插入片段大小为100 kb。选取其中一个大小为140 kb的BAC质粒进行功能验证,实验证明通过接合转移和原生质体转化的方法都能够将这个大型BAC质粒导入链霉菌模式菌株,并通过位点特异性重组整合到染色体中进行异源表达。【结论】BAC载体pMSBBACs可成功用于放线菌大片段基因组DNA的克隆和异源表达实验。     

ΦC31位点特异性整合酶DNA结合功能域的鉴定

DNA结合功能域的确定是阐明位点特异性重组酶整合机制的关键,而对酶DNA结合功能域进行突变研究是提高酶整合效率和整合特异性的重要方法.为了鉴定ΦC31位点特异性整合酶的DNA结合功能域,依据对ΦC31整合酶序列的生物信息学分析结果,利用PCR和克隆技术在pET22b原核表达载体上构建ΦC31整合酶重组截短突变体表达质粒,将获得的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株扩大培养并用IPTG诱导融合蛋白的表达,经镍柱纯化获得了纯度达90%以上的重组蛋白,分子量也与预期大小一致,Western印迹确定了重组蛋白的特异性.凝胶迁移滞后实验显示野生型以及截短突变体蛋白ΦC311-528、ΦC311-472、ΦC311-413能与细菌附着位点DNAattB和噬菌体附着位点DNAattP结合的条带,而截短突变体ΦC311-353、ΦC311-279、ΦC311-120观察不到相应的结合条带.6个截短突变体质粒在体内重组活性蓝白斑实验中均表现为蓝斑,显示出皆丧失体内重组活性.研究证实,ΦC31整合酶半胱氨酸富集域(第353～413位氨基酸)具有DNA结合的功能,而C末端缬氨酸富集区(第528～613位氨基酸)也与其重组活性相关.这为进一步了解ΦC31整合酶的结构与功能,最终引导其结构进化,提高其特异性和整合效率奠定了基础.     

噬菌体整合酶介导的位点特异性基因治疗

将治疗基因整合到患染色体上的特定位点并实现稳定的表达是基因治疗的关键,包括病毒载体和转座子系统在内的几种技术已经用于整合,但都存在治疗基因负载力较小及随机整合的应用障碍。来自链霉菌噬菌体中C31、R4及来自乳酸乳球菌噬菌体TP901-1的整合酶,能够识别有限数量的天然基因组序列(假att位点)．从而催化治疗基因位点特异性地整合进入高等真核生物基因组。这种新型的噬菌体整合酶系统在基因负载力及染色体的特异性整合方面具有很大的优越性。迄今为止,这种系统已经成功用于几种基因治疗的研究模型中．将会成为基因治疗的有用工具。     

灰色链霉菌胰蛋白酶在变铅青链霉菌中的异源表达及酶学性质分析

胰蛋白酶作为一种重要的丝氨酸蛋白酶被广泛应用于食品、医药和皮革等工业领域.本文成功实现了灰色链霉菌来源的胰蛋白编码基因在变铅青链霉菌中的高效活性表达,并对其酶学性质进行分析比较.以灰色链霉菌ATCC10137基因组为模板,获得胰蛋白酶编码基因sprT并克隆至表达质粒pIJ86,成功构建了重组链霉菌工程菌TK24/pIJ86-sprT.以R2YE和SELF为发酵培养基,最高酶活分别达9.21 U/mL和8.61 U/mL.酶学性质分析表明,和牛胰蛋白酶(BT)相比,重组链霉菌胰蛋白酶(rSGT)的耐酸能力强,具有较广的pH;且rSGT对酰胺键具有更高的特异性;此外,Zn2+和有机溶剂分别对rSGT的酯酶活力和酰胺酶活力具有促进作用;本研究结果为rSGT的性质改造以及工业应用提供了依据.     

干扰素诱导Mx—Cre转基因小鼠表达的重组酶活性的体外检测

利用PCR、Western blot、免疫组化、免疫金标电镜、Southern blot从DNA水平,蛋白水平分析干扰素诱导后Mx-Cre转基因小鼠肝组织中Cre重组酶的表达及其表达产物的活性,在对Mx-Cre转基因小鼠基因组中整合有cre基因进行确定后,通过干扰素诱导Mx-Cre转基因小鼠表达Cre重组酶,结果表明转基因小鼠肝细胞核和细胞质中均有Cre重组酶的表达,并在超微水平进一步证实,将含表达的Cre重组酶的肝细胞核抽提液加入到带有loxP位点的DNA中进行重组,分析证明Mx-Cre转基因小鼠表达的Cre重组酶具有重组活性,从而建立了体外检测Mx-Cre转基因re重组酶活性的方法。