半边旗二萜类成分PAG通过ROS诱导肝癌细胞凋亡的作用研究

探讨半边旗二萜类成分Pteisolic acid G(PAG)对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响及作用机制。用不同浓度的PAG处理HepG2细胞后,采用MTT法检测细胞存活率;采用PI单染法检测细胞周期分布;采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;采用RT-PCR和Western Blotting检测细胞内mRNA和蛋白表达情况;采用DCFH-DA法检测细胞内ROS水平,采用ROS抑制剂乙酰半胱氨酸(NAC)评价PAG细胞增殖抑制作用对ROS的依赖性。结果表明,在24 h、48 h和72 h时,PAG可剂量依赖性地抑制HepG2细胞的增殖(p0.05),IC_(50)分别为64.8μmol/L,38.5μmol/L和24.8μmol/L;用药24 h时PAG可剂量依赖性地使HepG2细胞阻滞在G_2/M期,同时增加HepG2细胞凋亡率(p0.05);PAG可剂量依赖性地降低HepG2细胞内Bcl-2 mRNA和caspase 3、PARP、Bcl-2蛋白的表达(p0.05),增加Bax mRNA和actived-caspase 3、cleaved-PARP、Bax蛋白的表达(p0.05)。当使用1 mmol/L的ROS抑制剂NAC预处理HepG2细胞时,PAG对HepG2细胞增殖抑制作用被显著阻断。上述结果表明,半边旗二萜类成分PAG可提高Bax/Bcl-2的基因和蛋白表达比值,从而诱导肝癌细胞HepG2凋亡,该作用可能是通过升高细胞内ROS水平来实现的。     

二烯丙基三硫通过线粒体依赖性途径诱导人肝癌HepG2细胞凋亡

二烯丙基三硫(diallyl trisulfide,DATS)对多种肿瘤有抗癌作用,但机制尚不完全清楚．为探讨DATS对人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡的影响,用丫啶橙/溴化乙锭(AO/EB)法观察细胞凋亡情况,在显微镜下计数凋亡细胞数．JC-1荧光染色观察线粒体膜电势变化．Western blot法检测细胞色素c蛋白分布,ELISA法检测caspase-3活性． 结果显示,DATS诱导HepG2细胞凋亡,用 50 μmol/L 与100 μmol/L DATS处理48 h,细胞凋亡率分别达到60.33%和93.67%,并引起HepG2细胞线粒体膜电势降低．Western blot显示,DATS能诱导胞浆细胞色素c增加,与此同时,线粒体细胞色素c减少,诱导HepG2细胞caspase-3活化．提示：DATS可通过降低线粒体膜电势,促进细胞色素c由线粒体膜释放到胞浆中,激活caspase-3途径诱导人肝癌细胞系HepG2细胞凋亡．     

二烯丙基二硫诱导人白血病K562 细胞凋亡及其对Bax、Bag-1 表达的影响

目的:探讨二烯丙基二硫(Diallyl disulfide)诱导白血病K562细胞凋亡的作用及其机制。方法:采用吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色法观察细胞凋亡形态学变化;DNA琼脂糖凝胶电泳测定DNA梯度带;RT-PCR法检测BAG-1、BAX基因的mRNA表达变化。结果:DADS可诱导K562细胞凋亡。其对K562细胞的凋亡效用与药物浓度、有明显依赖关系;DNA琼脂糖凝胶电泳示:40mg/LDADS作用K562细胞48小时后能够产生明显的梯形电泳图谱(DNA ladder):DADS作用48h后,BAX mRNA表达水平较对照组上调;BAG-1 mRNA较对照组下调(差异具有统计学意义,P<0.05)。结论:DADS能够诱导K562细胞凋亡,其凋亡机制可能与上调BAX,下调BAG-1有关。     

二烯丙基二硫对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞的影响

观察二烯丙基二硫(DADS)对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞的影响,除空白对照组外,其余各组加入IL-1β(10 ng/m L)诱导24 h后换DADS处理,通过CCK8实验、平板克隆实验检测增殖能力,Western blot实验检测MMP13、TIMP1和CollagenⅡ蛋白表达水平。结果发现:12.5和25μmol/L DADS对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞有增殖作用(P0.05),50和100μmol/L DADS对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞有抑制作用(P0.05);12.5和25μmol/L DADS显著增加IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞克隆集落形成能力(P0.05),50μmol/L DADS显著抑制IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞克隆集落形成能力(P0.05);DADS能显著抑制MMP13的表达,增加TIMP1和CollagenⅡ的表达。以上结果提示DADS对IL-1β诱导SD大鼠关节软骨细胞具有双向调节作用,25μmol/L DADS保护关节软骨细胞的分子机制可能与DADS显著抑制MMP13的表达,增加TIMP1和CollagenⅡ的表达相关。     

二烯丙基二硫诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡及机制的研究

目的:研究二烯丙基二硫(DADS)诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡及其分子机制。方法:AO／EB荧光染色法、流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot法检测DADS对caspase-3剪切片断的影响,及对MAPKs通路相关蛋白,包括p-JNK、JNK表达的影响。结果:DADS对乳腺癌细胞株MCF-7生长具有明显的抑制作用,经AO／EB形态变化分析,可见明显的细胞凋亡特征;DADS处理MCF-7细胞6、12、24、48 h,流式细胞仪检测细胞的凋亡率分别为3．74％、9．22％、20.2％、42％,而对照组细胞的凋亡率仅为3．03％(P<0．05);不同浓度的DADS作用于MCF-7细胞24 h后,Western blot法检测发现caspase-3出现断裂片断,并随着浓度的增加断裂更明显。进一步研究发现,DADS处理MCF-7细胞后,JNK磷酸化水平明显升高。结论:DADS能诱导乳腺癌细胞株MCF-7细胞凋亡,JNK信号通路抑制可能是DADS诱导其调亡的分子机制之一。     

二烯丙基二硫对人白血病K562细胞增殖及Bcl-2表达的影响

目的:探讨二烯丙基二硫(DADS)对白血病K562细胞增殖的影响,以及Bcl-2表达的调节作用.方法:用DADS预处理白血病K562细胞构建细胞模型,MTT法分别检测不同DADS浓度(5 gmL-1、10 g mL-1、20 g mL-1、40 g mL-1)和不同处理时间(6h、12h、24h、48h)细胞增殖情况,IC50浓度处理白血病K562细胞之后,Western blot和RT-PCR检测Bcl-2蛋白和mRNA表达水平.结果:MTT结果显示DADS能够抑制白血病K562细胞的增殖,且呈剂量和时间依赖性;IC50浓度的DADS处理K562细胞24小时后,Bcl-2蛋白和mRNA的表达量显著减少.结论:DADS可显著抑制K562细胞增殖,而这一作用可能与Bcl-2表达下调有关.     

靶向survivin 的siRNA 联合5-FU 转染抑制肝细胞株HepG2 增殖的研究

目的:研究靶向survivin的(小分子干扰RNA)siRNA和(氟尿嘧啶)5-FU联用对肝癌细胞HepG2的增殖抑制及凋亡的影响。方法:将HepG2细胞分为空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组、siRNA转染组、5-FU+siRNA转染组。转染采用脂质体法。RT-PCR法检测HepG2细胞survivin mRNA转录水平;MTT法检测靶向survivin的siRNA和5-FU对HepG2细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测HepG2细胞凋亡情况。结果:空白对照组、阴性对照组、5-FU处理组survivin mRNA表达无明显变化(P>0.05),siRNA转染组、5-FU+siRNA转染组survivin mRNA表达明显下降(F=280.326,q=4.72~7.34,P<0.05)。5-FU+siRNA转染组增殖抑制率为51.58%±1.35%,与其它各组相比抑制率明显增高(F=280.326,q=5.27~9.84,P<0.05)。5-FU+siRNA组与其它各组相比细胞凋亡率明显增高(F=13568.68,q=110.47～327.16,P<0.01)。结论:将靶向survivin的siRNA和5-FU联合应用可以显著抑制肝癌细胞survivin基因表达,并协同抑制HepG2细胞增殖,共同发挥诱导细胞凋亡作用。     

JKA97诱导HepG2凋亡及其分子机制研究

目的:研究药物JKA97对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用及其分子机制.方法:采用MTT法观察药物JKA97对细胞增殖的影响;倒置显微镜观察细胞形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot方法检测线粒体融合蛋白mfn2表达水平变化.结果:药物JKA97抑制人肝癌细胞HepG2细胞增殖,5、10、20 μmol/L作用组24 h抑制率分别为34.26%、43.08%、54.02%;药物JKA97诱导人肝癌细胞HepG2凋亡,10、20 μmol/L JKA97作用HepG2细胞24h,细胞凋亡率分别为22.9%、72.9%;线粒体融合蛋白mfn2表达水平显著降低.结论:药物JKA97对人肝癌细胞HepG2生长具有明显的增殖抑制作用,诱导细胞凋亡;线粒体融合蛋白mfn2表达水平降低可能是其重要的分子机制之一.     

γ-生育三烯酚联合亚砷酸对急性早幼粒细胞NB4生长的抑制作用及机制

目的:研究γ-生育三烯酚联合亚砷酸对急性早幼粒细胞NB4生长的抑制作用及可能的分子机制。方法:采用CCK-8、细胞周期实验检测细胞增殖、利用激光共聚焦显微镜、Annexin V/PI染色、Caspase活性检测、Western Blot等方法测定细胞凋亡。采用1μmol/L ATO及不同浓度(0、15、30、45μmol/L)的γ-生育三烯酚处理NB4细胞24、48和72小时,通过CCK-8检测细胞的增殖情况,流式细胞术、激光共聚焦显微镜检测细胞周期和凋亡情况,检测Caspase3,8,9的活性,Western Blot检测细胞中c-caspase-3、Bcl-2和survivin的蛋白表达。结果:γ-生育三烯酚联合亚砷酸显著抑制NB4细胞增殖(P0.01),且随着作用时间延长和γ-生育三烯酚浓度的增加,其增殖抑制作用增强;细胞周期阻滞在S期,S期的比例由38.21%±2.99上升到50.31%±5.03;γ-生育三烯酚联合亚砷酸诱导NB4细胞凋亡,1μmol/L ATO联合15、30μmol/L的γ-生育三烯酚处理48h后,细胞活率分别为82.27%±3.16、66.97%±3.17、12.63%±2.66;1μmol/L ATO联合30μmol/L的γ-生育三烯酚处理后,NB4细胞caspase-3,-8,-9的活性均较ATO单独用药组显著增高,c-caspase-3表达增高而Bcl-2和survivin蛋白的表达无明显变化。结论:生育三烯酚联合亚砷酸对急性早幼粒细胞NB4的生长具有抑制作用,此作用可能与抑制增殖并诱导凋亡相关,其作用靶点可能与促进Cas-pase诱导的凋亡有关。     

二苯乙烯苷对氧化诱导内皮细胞凋亡及Caspase-3和PARP表达的影响

为研究二苯乙烯苷对过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的影响并初步探讨二苯乙烯苷抗凋亡的可能机制,采用不同浓度H2O2和二苯乙烯苷处理内皮细胞24 h,以MTT法检测细胞生长活力、Hoechst33258染色观察细胞形态、流式细胞仪检测凋亡率等方法筛选造模内皮细胞凋亡的H2O2浓度和二苯乙烯苷最佳的抗内皮细胞凋亡作用浓度.RT-PCR、Western-blot分别检测Caspase-3、PARP mRNA及蛋白质的表达.结果发现,与空白对照组相比,300μmol/L H2O2作用后,内皮细胞增殖明显受到抑制,Hoechst33258染色可见大量凋亡细胞,细胞凋亡率显著增加,流式细胞仪检测出明显的凋亡峰,Caspase-3和多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)的表达量显著增加.经二苯乙烯苷处理后,随着二苯乙烯苷浓度增加,细胞的增殖率随之增加,凋亡细胞数减少,凋亡率逐渐降低,与H2O2组比较,10μmol/L的二苯乙烯苷能够显著提高细胞增殖率,降低细胞凋亡率,并显著减少Caspase-3和PARP表达.以上结果表明,二苯乙烯苷能够抑制由H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡,增加细胞生长活性,降低细胞凋亡率,其作用机制可能与下调Caspase-3和多聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶(PARP)的表达有关.