人血小板衍生生长因子BB亚型包涵体复性与纯化

目的:优化人血小板衍生生长因子BB亚型(PGDF-BB)包涵体复性方法与纯化条件,获得具有较好生物活性的重组PGDF-BB蛋白。方法:对PGDF-BB包涵体以梯度尿素进行变性,选择最佳包涵体变性浓度;比较不同复性条件下的复性率,稳定PGDF-BB包涵体复性方法;参照该蛋白的理化性质,选择适合PGDF-BB重组蛋白的纯化方法。结果:原核系统内实现了PGDF-BB的高表达;通过优化包涵体复性方法,重组蛋白的包涵体复性率可达40%以上;经过多个纯化方法相结合,PGDF-BB的纯度达到95%。结论:通过实验条件的优化,提高了PGDF-BB包涵体复性率,获得高纯度、高生物活性的重组PGDF-BB蛋白。     

大肠杆菌表达Trx-rPA融合蛋白的复性纯化

大肠杆菌高密度发酵以包涵体形式表达融合蛋白Trx-rPA,表达量22%。包涵体蛋白洗涤后经金属螯合层析纯化,纯度达80%以上。经胱氨酸衍生,以脉冲加样形式复性,复性率可高达30%。经ETI-Sepharose纯化,复性的融合蛋白生物活性可达3.5×105IU/mgPr.。融合蛋白可被rEK酶切释放rPA,酶切效率达85%以上。酶切液经IDA-Sepharose和SP-Sepharose层析纯化,rPA纯度达98%以上,生物活性50万IU/mgPr.。1L发酵液经分离、复性及纯化后,可得高纯度rPA300mg以上。     

猪囊尾蚴CE18重组蛋白的复性纯化及抗原性鉴定

猪囊尾蚴CE18重组蛋白(rCE18)在大肠杆菌表达后形成包涵体, 为了获得高纯度的、有生物活性的rCE18, 本研究采用超声破碎菌体, 0.2%、2% DOC(脱氧胆酸钠)逐次洗涤包涵体及0.9% SKL(十二烷基肌氨酸钠)溶解包涵体后, 利用透析与凝胶过滤层析技术相结合对rCE18进行复性和纯化。同时, 采用GST-FF亲和柱层析及SDS-PAGE胶回收蛋白两种方法纯化rCE18, 比较三者的纯化效果。并通过间接ELISA检测复性蛋白的生物学活性。结果表明: 经透析与凝胶层析复性纯化后的rCE18蛋白的纯度可达到60%以上, 活性回收率为41.3%, 间接ELISA证实, 复性后的rCE18蛋白能特异性识别猪囊虫阳性血清, 检测敏感性高达97.2%, 与全囊虫抗原检测的符合率为100%。本试验初步建立了猪囊尾蚴rCE18包涵体纯化及复性的有效方法, 为猪囊尾蚴rCE18蛋白的诊断应用奠定了基础。     

VISTA-Ig融合蛋白的表达及其包涵体复性研究

[目的]构建VISTA-Ig融合蛋白表达载体,进行诱导表达获得VISTA-Ig融合蛋白。[方法]以C57BL/6小鼠脾脏细胞c DNA为模板,扩增小鼠VISTA胞外段基因,利用重叠延伸PCR的方法合成VISTA-Ig融合基因,构建重组质粒p ET-22b-VISTA-Ig,在大肠杆菌表达菌株E.coli BL21(DE3)中诱导表达。[结果]VISTA-Ig融合蛋白主要以包涵体的形式存在。变性后,利用镍柱纯化,通过采用氧化型/还原型谷胱甘肽(GSH/GSSG)复性体系,复性效率达到80%以上,提高了复性效率。利用r Protein A柱对目标蛋白进一步纯化,Western Blot鉴定结果显示,能与Ig G Fc(HRP)抗体特异性结合。[结论]成功构建了重组质粒p ET-22b-VISTA-Ig,纯化的VISTA-Ig包涵体蛋白复性效率得到明显提高,为后续VISTA-Ig免疫学功能的研究奠定了基础。     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

表达猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用.将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E0基因分别插入原核表达质粒pGEX4T,pET30,pMAL-p2X中,并分别以BL21和BL21-codonplus(DE3)-RP, BL21(DE3)和BL21-codonplus(DE3)-RP,TB1和BL21-codonplus(DE3)-RP为表达菌株.通过摸索IPTG诱导浓度,诱导温度,菌体收获时间,确定E0基因能在pGEX4T/ BL21-codonplus(DE3)-RP和pMAL-p2X/ BL21-codonplus(DE3)-RP中获得高效表达,表达产量分别占菌体总蛋白的15%和30%,表达的重组蛋白主要为包涵体形式.分别采用B-per试剂和超声波裂解配以曲通尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果.使用分步透析法对变性的包涵体进行复性,将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-E0融合蛋白.以GST-E0融合蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础.     

蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B催化活性区的原核表达及活性分析

从GenBank获得人PTP1B催化活性区(PTP1Bc)氨基酸序列(1~301aa), 通过重叠PCR获得PTP1Bc基因。构建 pET-22b(+)/PTP1Bc原核表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 阳性重组子IPTG诱导表达, Ni柱纯化蛋白。目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白30%以上。纯化后, 蛋白纯度达95%以上。Western blotting结果表明所得的蛋白可与抗 PTP1B抗体发生特异性结合; 酶活实验证实复性的蛋白具有一定的磷酸酶活性。PTP1Bc基因的构建、表达纯化及活性分析, 为进一步的功能研究奠定了基础。     

蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B催化活性区的原核表达及活性分析

从GenBank获得人PTP1B催化活性区(PTP1Bc)氨基酸序列(1~301aa), 通过重叠PCR获得PTP1Bc基因。构建 pET-22b(+)/PTP1Bc原核表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 阳性重组子IPTG诱导表达, Ni柱纯化蛋白。目的蛋白以包涵体的形式表达, 表达量占菌体总蛋白30%以上。纯化后, 蛋白纯度达95%以上。Western blotting结果表明所得的蛋白可与抗 PTP1B抗体发生特异性结合; 酶活实验证实复性的蛋白具有一定的磷酸酶活性。PTP1Bc基因的构建、表达纯化及活性分析, 为进一步的功能研究奠定了基础。     

人乳头瘤病毒18型L1蛋白的包涵体和可溶性表达及纯化

目的:原核表达系统表达人乳头瘤病毒18型(HPV18)L1蛋白,建立包涵体和可溶性表达的L1蛋白的纯化方法。方法:构建重组表达质粒p GEX-4T-1-HPV18 L1,在大肠杆菌BL21中以包涵体和可溶性方式表达HPV18 L1蛋白。通过超声波破碎菌体、洗涤包涵体、碱变性、透析复性和谷胱甘肽(GST)琼脂糖凝胶4B亲和层析纯化包涵体蛋白;在菌体中加入三磷酸腺苷(ATP)和3.5 mol/L尿素孵育后,GST 4B亲和层析纯化可溶性蛋白,凝血酶酶切。SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达和纯化产物。结果:SDS-PAGE结果表明,HPV18 L1蛋白以包涵体和可溶性方式在大肠杆菌BL21内高效表达,均产生相对分子质量约为86 000的HPV18 L1-GST融合蛋白。Western印迹结果显示,包涵体纯化后获得的融合蛋白降解条带较多;而可溶性蛋白纯化后获得的融合蛋白未降解,凝血酶酶切后得到HPV18 L1蛋白,可与HPV18 L1蛋白单克隆抗体结合。结论:采用原核系统表达了HPV18 L1-GST融合蛋白,分别建立了包涵体和可溶性蛋白的纯化方法,获得HPV18 L1蛋白,为其进一步应用奠定了基础。     

丙肝抗原决定簇与CTB的融合、表达及融合蛋白的纯化

通过固相化学合成法合成了编码丙型肝炎病毒(HCV)结构区和非结构区的4个抗原决定簇基因,这些抗原决定簇基因片段以不同方式串联后与ctxB基因融合,构建了12种表达不同嵌合蛋白的重组质粒,各重组质粒转化大肠杆菌后均能高效分泌性表达融合蛋白,表达产量在10～50μg/ml之间,随所融合的抗原决定簇不同而不同,表达水平主要与抗原决定簇的氨基酸组成有关,而与抗原决定簇的大小及串联次数关系不大。融合蛋白通过亲和层析纯化,达到了电泳纯,为进一步研究融合蛋白的抗原性及用作抗-HCV ELISA诊断试剂抗原打下了基础。     

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

表达猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用.将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E0基因分别插入原核表达质粒pGEX4T,pET30,pMAL-p2X中,并分别以BL21和BL21-codonplus(DE3)-RP, BL21(DE3)和BL21-codonplus(DE3)-RP,TB1和BL21-codonplus(DE3)-RP为表达菌株.通过摸索IPTG诱导浓度,诱导温度,菌体收获时间,确定E0基因能在pGEX4T/ BL21-codonplus(DE3)-RP和pMAL-p2X/ BL21-codonplus(DE3)-RP中获得高效表达,表达产量分别占菌体总蛋白的15%和30%,表达的重组蛋白主要为包涵体形式.分别采用B-per试剂和超声波裂解配以曲通尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果.使用分步透析法对变性的包涵体进行复性,将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST-E0融合蛋白.以GST-E0融合蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础.     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.