基于组学技术的维生素C二步混菌发酵研究进展

二步发酵法是工业化生产维生素C (vitamin C, Vc)的主要方法,其中第二步由伴生菌与产酸菌(普通生酮基古龙酸菌)组合进行混菌发酵产生Vc前体2-酮基-l-古龙酸(2-keto-l-gluonic acid, 2-KLG)的机制,一直是科研人员研究的重要科学问题。通过高通量基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学等组学技术揭示生物系统中各个组分相互作用关系已经成为主要的研究手段。本文对近年来利用组学技术解析Vc混菌发酵中两菌互作关系、解除发酵系统的氧化胁迫、伴生活性物质、产酸菌群体感应、外源添加物、基因工程改造产酸菌促进产2-KLG等方面的研究进行综述,并为进一步的探索和深入研究提供思路。     

混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体2-酮基-L-古龙酸研究进展

利用混合菌发酵L-山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸(2-KCA),再经化学转化合成维生素C(Vc),是我国工业生产Vc的主要途径,具有简化工艺,减少污染,降低能耗等诸多优点.从菌系组合、菌种选育、代谢途径与酶学特性、工程菌构建、伴生作用机制及发酵工艺等方面出发,综述混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体2-KGA的研究现状和最新进展,并提出进一步研究和探索的方向.     

一种Vc二步发酵伴生菌的初筛方法

目的：建立一种Vc二步发酵高效伴生菌的快速初筛方法。方法：通过测定OD650,以伴生菌进入对数期的早晚和对数期持续长短为判断菌株伴生潜力的依据。结果：10h前进入对数期,对数期持续时间约12h的菌株具有高效的促进小菌生长和发酵产古龙酸的潜力。概率为71%。结论：以伴生菌进入对数期的早晚和对数期持续长短为判断依据的新的菌株快速初筛方法,简便、高效,利于大规模初筛应用。     

维生素C第二步混菌发酵技术研究新进展

维生素C(简称维C)"两步发酵法"是我国科学家独创、目前唯一工业化应用的维C工业生产技术,其显著特征是第二步发酵为两种菌的混合发酵。综述了近年来我国在维C第二步发酵技术领域的最新研究进展。大量研究认为混菌发酵效率取决于产酸菌数量和催化酶(山梨糖脱氢酶)活性,而产酸菌的转化能力又依赖于伴生菌所释放的"伴生物质",并认为伴生菌的"伴生物质"应该有多种,除了大家所公认的蛋白类物质外,氨基酸、维生素、嘌呤类等小分子有机物也具有促进产酸菌生长和产酸的作用,都应归属于"伴生物质"。另外,列举了当前维C工业化生产中面临的技术难题,提出了解决思路和未来研究方向,以期对推动维C发酵技术进步和维C产业可持续发展提供参考。     

Vc二步发酵新组合菌系B15-14的筛选及其条件优化

筛选出了一组Vc二步发酵的新组合菌系(命名为B15-14),研究了环境因子对新菌系产酸的影响.结果显示:新组合菌系的最适底糖浓度为7%;温度为29～33℃,31℃为最适;适当增加通气量(20～30 mL装液量,250 mL三角瓶)有利于产酸;起始pH值范围为6.0～7.5;以Bt菌做伴生菌时.发酵40 h就已达到终点.明显缩短了发酵时间.     

玉米浆对Vc二步发酵产2-酮基-L-古龙酸影响的研究

通过在培养基中添加不同量的玉米浆,研究其对氧化葡萄糖酸杆菌（俗称小菌）生产Vc前体2-酮基-L-古龙酸的影响,并研究玉米浆成分中的12种主要氨基酸对小菌产酸的影响。结果表明：每100 mL发酵培养基中添加2.5 g左右过滤除菌玉米浆时,2-酮基-L-古龙酸产量高达26.84 mg/mL,小菌活菌数为不添加玉米浆时小菌单菌发酵下的9.74倍。过量玉米浆抑制小菌产酸。12种氨基酸单独与氧化葡萄糖酸杆菌发酵培养及全部混合后与氧化葡萄糖酸杆菌发酵培养对产酸及菌体生长无影响。     

山梨酮脱氢酶模块与酮古龙酸杆菌底盘细胞的适配分析

酮古龙酸杆菌Ketogulonigenium vulgare是维生素C二步混菌发酵过程中的产酸菌。山梨酮脱氢酶(L-sorbosone dehydrogenase,缩写为SNDH)作为维生素C直接前体2-酮基-L-古龙酸(2-KGA)合成的关键酶,其作用机制并不十分清楚。借助全基因组测序抽提2个山梨酮脱氢酶基因,分别位于基因组(缩写为sndhg)和质粒(缩写为sndhp)上。通过工程化改造技术在工业产酸菌中构建山梨酮脱氢酶功能模块,比较其对2-KGA产量的影响。研究发现sndhg过表达对菌株产酸影响不明显,sndhp过表达使菌株明显产生副产物。将sndhg和sndhp分别配合辅因子PQQ合成基因pqq A,分别构建sndhg-pqq A和sndhp-pqq A模块,得到的工程菌株产酸情况与之前的结果大致相同。将4株K.vulgare工程菌株分别与内生芽孢杆菌Bacillus endophyticus混合培养传代50 d后,分离菌株进行混菌发酵,其2-KGA的转化率分别提高了15.4%、179%、0.65%和125%。表明混菌适应性进化策略是一种增加功能模块与底盘细胞适配性,进而快速获得优良性状菌种的有效方法。     

一种Vc二步发酵伴生菌的筛选方法

采用发酵种液离心法对Vc二步发酵伴生菌筛选方法进行研究。将发酵12h的发酵液4000r／min离心l0min,取上清液以20％的接种量接入种子发酵液中（30ml／250m1）,再接入1／20环大菌,29℃振荡（180r／min）培养24h,将发好种液以15％接种量转接摇瓶发酵（20ml/250ml）,29℃振荡（180r／min）培养,待残糖降至lmg/ml以下测酸。摇瓶发酵结果表明,此方法易操作、效率高,可应用于伴生菌筛选的初筛过程中。     

以掷孢酵母作为伴生菌产生VC前体KGA的研究

以掷孢酵母作为伴生菌与氧化葡萄糖酸杆菌组成新混菌体系,通过测定生长代谢曲线,对其产酸性能和特点进行了研究。结果表明：相同条件下,新菌系产酸能力高于现有菌系,酸量增加5-7mg/ml,发酵周期缩短6-8h,酸转化率提高3-4%,最高产酸点pH值下降约0.5个单位,表现出较大的产酸潜力和可修饰性。     

混菌状态对新菌系产生VC前体KGA的影响

通过测定氧化葡萄糖酸杆菌产酸变化,研究了新菌系混菌状态对产酸的影响。结果显示：新混菌体系中,种液KGA为4.1-5.5mg/ml,混合菌菌群氧化葡萄糖酸杆菌/掷孢酵母为26-35：1,混菌生物量达0.46-0.60(OD值）,有利于二菌在发酵中相互协调,促进产酸,调节接种生物量可增加产酸速度,缩短产酸周期,但不影响最终产酸量。