干扰LRP16基因表达对人卵巢癌耐药SKOV3/DDP细胞耐药性的影响及机制研究

目的:探究干扰人白血病相关蛋白16(LRP16)基因表达对人卵巢癌耐药SKOV3/DDP细胞耐药性的影响及其相关机制。方法:采用Real-time PCR和蛋白免疫印迹(WB)检测LRP16在敏感组(SKOV3细胞)、耐药组(SKOV3/DDP细胞)、LRP16干扰组(SKOV3/DDP细胞-稳定转染LRP16 shRNA质粒)和NC组(即阴性对照组,SKOV3/DDP细胞-稳定转染阴性对照质粒)细胞中的表达情况;MTT试验检测LRP16对SKOV3/DDP细胞耐药性的影响;彗星试验检测LRP16对顺铂(DDP)诱导DNA损伤的影响;流式细胞术(FCM)试验检测细胞凋亡变化;WB试验检测PTEN、p-Akt和NF-κB蛋白表达水平。结果:LRP16干扰组细胞的耐药指数(RI)值(3.19±0.21)显著低于耐药组细胞(6.84±0.37)(P0.05)。DDP(25μmol/L)处理24 h后,LRP16干扰组DNA损伤的细胞百分比、细胞凋亡百分比均显著低于耐药组和NC组(P均0.05),而耐药组和NC组比较差异无统计学意义(P0.05);LRP16干扰组细胞PTEN蛋白相对表达量高于耐药组和NC组(P均0.05),而p-Akt和NF-κB相对表达量低于耐药组和NC组(P均0.05)。结论:干扰LRP16基因表达可逆转卵巢癌耐药SKOV3/DDP细胞的耐药性,PTEN/Akt/NF-κB可能是其中的关键信号通路。     

大黄素对顺铂耐药卵巢癌细胞的逆转作用及其相关基因表达研究

为了研究大黄素对人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP细胞耐药逆转作用及其机制,本研究以卵巢癌SK-OV3和多药耐药细胞株SKOV3/DDP为研究对象,通过噻唑蓝(MTT)法测定SKOV3/DDP细胞的耐药指数和大黄素在无细胞毒浓度下对卵巢癌细胞耐受顺铂(DDP)的逆转作用;采用Real-time PCR技术检测耐药相关基因HIF-1α、STAT1、CK2α、GSTP1 mRNA表达情况。结果发现无细胞毒作用浓度的7.8 mg/L和3.9 mg/L大黄素能逆转SKOV3/DDP细胞对DDP的耐药性,对DDP的逆转倍数分别为1.91倍和1.30倍,与SKOV3比较,SKOV3/DDP细胞的HIF-1α、STAT1、CK2α、GSTP1 mRNA表达明显升高(P<0.01)。3.9 mg/L和7.8 mg/L大黄素作用均可下调HIF-1α、CK2α、STAT1 mRNA表达,存在剂量-效应依赖关系。7.8 mg/L大黄素作用可下调GSTP1 mR-NA表达,但3.9 mg/L大黄素作用不明显。7.8 mg/L和3.9 mg/L大黄素联合IC50浓度的DDP时,四个耐药相关基因的表达与单独化疗药组作用相比明显下调(P<0.01)。提示无细胞毒浓度的大黄素对卵巢癌细胞耐药逆转的作用可能是通过下调HIF-1α、STAT1、GSTP1、CK2α的表达起作用。     

姜黄素在宫颈癌治疗中对MIF、VEGF-C、P53表达及肿瘤生长的影响

为了揭示姜黄素治疗宫颈癌的实验效果及其作用机制。选取成功建立的宫颈癌Caski细胞移植瘤裸鼠48只,随机分为空白组(等量生理盐水灌胃)、顺铂组(顺铂3 mg·g~(-1)·d~(-1))、高剂量组(100 mg·kg~(-1)·d~(-1))、低剂量组(50 mg·kg~(-1)·d~(-1)),每组12只,连续处理15 d后,对比各组小鼠肿瘤体积、瘤体重量、抑瘤率,采用流式细胞仪技术检测各组小鼠肿瘤组织中Caski细胞周期分布情况、采用RT-PCR技术和Western-blotting技术检测各组小鼠瘤组织中巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、血管内皮细胞生长因子-C(VEGF-C)、p53mRNA及蛋白的表达情况。结果显示,顺铂组、高剂量组、低剂量组的小鼠肿瘤体积、肿瘤重量均显著低于空白组(p0.05),顺铂组、高剂量组的小鼠肿瘤体积、肿瘤重量显著低于低剂量组(p0.05),顺铂组、高剂量组的抑瘤率显著高于低剂量组(p0.05);顺铂组、高剂量组、低剂量组的G1期细胞比例低于空白组(p0.05);顺铂组、高剂量组的G1期细胞比例低于低剂量组(p0.05),而S期及G2/M期细胞比例高于低剂量组(p0.05);顺铂组、高剂量的MIF、VEGF-C mRNA表达低于低剂量组(p0.05),顺铂组、高剂量的p53mRNA表达高于低剂量组(p0.05);顺铂组、高剂量组、低剂量组的MIF、VEGF-C蛋白低于空白组(p0.05);顺铂组、高剂量组的MIF、VEGF-C蛋白低于低剂量组(p0.05),而p53蛋白高于低剂量组(p0.05)。姜黄素能有效抑制宫颈癌Caski细胞移植瘤裸鼠肿瘤细胞的生长,可能与下调MIF、VEGF-C及上调p53 mRNA及蛋白有关。     

RNA 干扰沉默缺氧诱导因子1α逆转肺癌细胞耐药性

目的:观察RNA干扰沉默缺氧诱导因子1α(HIF-1α)对肺癌细胞耐药性的影响。方法:构建靶向HIF-1α小干扰RNA基因,并转染到人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞中。逆转录聚合酶链反应RT-PCR)检测细胞的HIF-1α、多药耐药基因1(MDR-1)以多药耐药相关蛋白基因(MRP)mRNA变化,免疫细胞化学法观察干扰后HIF-1α、P-糖蛋白以及MRP蛋白的变化。MTT法检测不同浓度的顺铂作用下细胞死亡率。结果:HIF-1αsiRNA组中HIF-1α、MDR-1、MRP mRNA水平显著降低(P<0.05),且蛋白水平也显著下降(P<0.05)。HIF-1αsiRNA组细胞死亡率较未转染组均明显增高(P<0.05),转染siRNA阴性组不影响肿瘤细胞的耐药性。结论:HIF-1αsiRNA可显著降低A549/DDP细胞中HIF-1α、MDR-1、MRP表达,从而起到逆转肺腺癌A549/DDP细胞的耐药作用。     

沉默FBI-1基因对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响

本研究旨在观察短发夹状RNA (short hairpin RNA, shRNA)介导的人类免疫缺陷病毒短转录诱导物连接因子1 (FBI-1)基因沉默对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响。用qRT-PCR和Western blot分别检测FBI-1、Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3和Survivin的mRNA和/或蛋白的表达水平;采用shRNA干扰技术沉默MDA-MB-231细胞中FBI-1基因的表达;用CCK-8法以及克隆形成实验检测细胞增殖;用流式细胞术检测细胞凋亡;用裸鼠皮下成瘤实验检测细胞的成瘤能力。结果显示,MDA-MB-231细胞的FBI-1 mRNA和蛋白的表达水平明显高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A;经shRNA靶向沉默FBI-1基因表达后,细胞增殖能力明显降低,细胞凋亡率显著增高,伴随Bcl-2和Survivin蛋白表达明显下调、Bax蛋白表达显著上调和Caspase 3活化,MDA-MB-231细胞的裸鼠皮下成瘤能力受抑制。以上结果提示,靶向沉默FBI-1基因表达可以抑制MDA-MB-231细胞增殖,诱导细胞凋亡并抑制细胞的裸鼠皮下成瘤能力。     

西施舌多糖对人食管鳞癌裸鼠移植瘤作用的研究北大核心CSCD

构建人食管鳞癌EC-9706细胞裸鼠移植瘤模型,研究西施舌多糖对人食管鳞癌EC-9706细胞裸鼠移植瘤生长的影响。将移植瘤裸鼠随机分成5组,每天分别腹腔注射生理盐水(NS)、环磷酰胺(CTX,5 mg/kg)、西施舌多糖3个剂量(100、200、300 mg/kg),2周后,每3 d用游标卡尺测量肿瘤体积。实验持续26 d,实验结束后,处死裸鼠,称瘤重,计算抑瘤率。结果表明,不同浓度西施舌多糖对人食管鳞癌裸鼠移植瘤生长均有抑制作用,且西施舌多糖各剂量组中抑瘤率呈现剂量-效应关系,其中西施舌多糖300 mg/kg实验组效果最佳,抑瘤率达28.85%。     

氧化铁磁性纳米颗粒介导缺氧诱导因子1α shRNA质粒转染逆转A549/CDDP细胞对顺铂耐药的实验研究

评价了氧化铁磁性纳米颗粒作为缺氧诱导因子1α shRNA (HIF-1α shRNA) 重组质粒载体进行体内体外转染的可行性及其逆转人肺腺癌耐药细胞株(A549/CDDP)顺铂耐性的效果,并初步探讨相关机制．在成功构建HIF-1α shRNA重组质粒后,分别利用氧化铁磁性纳米颗粒及脂质体介导质粒转染A549/CDDP细胞及其移植瘤裸鼠动物模型,荧光显微镜检测转染效率,RT-PCR及细胞免疫化学检测转染后A549/CDDP 细胞HIF-1α、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance 1,MRP1)、肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein,LRP) mRNA及蛋白质表达,免疫组化检测转染后A549/CDDP移植瘤HIF-1α、MRP1及LRP蛋白表达,MTT法检测转染HIF-1α shRNA前后A549/CDDP细胞对顺铂的耐药性,并检测转染HIF-1α shRNA后A549/CDDP细胞移植瘤的肿瘤生长指数,HE染色检测纳米颗粒转染对裸鼠肝、肾及脑的组织学毒理作用．结果显示,氧化铁磁性纳米颗粒介导转染相对效率高于脂质体介导(P < 0.01),HIF-1α shRNA转染A549/CDDP细胞后HIF-1α、MRP1、LRP mRNA及蛋白质表达下降,逆转A549/CDDP细胞对顺铂耐性82%,纳米颗粒介导HIF-1α shRNA转染A549/CDDP细胞移植瘤裸鼠动物模型后,移植瘤组织中HIF-1α、MRP1及LRP蛋白表达下降,转染HIF-1α shRNA后抑制移植瘤的生长,且与顺铂有协同效应,纳米颗粒转染后裸鼠肝、肾及脑组织无坏死．这些结果说明,纳米颗粒介导HIF-1α shRNA的体内体外转染效率高于脂质体,RNA干扰技术封闭HIF-1α基因可较大程度逆转耐顺铂人肺腺癌细胞的耐药性及其抑制瘤的生长,其作用可能与HIF-1α shRNA降低HIF-1α、MRP1及LRP表达有关,HIF-1α基因可作为逆转肺癌耐药治疗的有效靶点,磁性纳米颗粒介导HIF-1α shRNA质粒转染具有一定的生物安全性．     

西施舌多糖对人食管鳞癌裸鼠移植瘤作用的研究

构建人食管鳞癌EC-9706细胞裸鼠移植瘤模型,研究西施舌多糖对人食管鳞癌EC-9706细胞裸鼠移植瘤生长的影响。将移植瘤裸鼠随机分成5组,每天分别腹腔注射生理盐水(NS)、环磷酰胺(CTX,5 mg/kg)、西施舌多糖3个剂量(100、200、300 mg/kg),2周后,每3 d用游标卡尺测量肿瘤体积。实验持续26 d,实验结束后,处死裸鼠,称瘤重,计算抑瘤率。结果表明,不同浓度西施舌多糖对人食管鳞癌裸鼠移植瘤生长均有抑制作用,且西施舌多糖各剂量组中抑瘤率呈现剂量-效应关系,其中西施舌多糖300 mg/kg实验组效果最佳,抑瘤率达28.85%。     

腺病毒介导hIL-24抑制裸鼠肝癌荷瘤生长及其机制研究

为了研究腺病毒hIL-24抑制SMMC-7721肝癌细胞裸鼠荷瘤的生长抑制及其作用机制,构建了重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-hIL-24(Ad-hIL-24),经PacI线性化后转染QBI-293A细胞,多轮感染后收获高效价腺病毒重组病毒子。用SMMC-7721肝癌细胞使16只裸鼠致瘤,然后随机NS分成干预组、5-Fu组、Ad组和Ad-hIL-24组,进行抗肿瘤试验。四组均使用瘤体内注射干预用药,100μL/只NS组、Ad组(107pfu)和Ad-hIL-24组(107pfu)隔日一次,共注射5次;5-Fu组20μg/kg,连续注射5d。用药前、用药后1周和2周分别测皮下瘤体的长径(L)、短径(W),计算出瘤体体积,治疗开始后第15天,将裸鼠脱颈处死,摘取瘤体称重,计算出抑瘤率。显微镜观察细胞生长形态、免疫组化法测caspase3蛋白表达、P53及P27核内抑癌基因表达、CD34染色标记测定的MVD及VEGF蛋白表达。与NS组比较,Ad-hIL-24组与5-Fu组的抑瘤率分别为68.52%(P<0.01)和65.64%(P<0.01);镜下Ad-hIL-24组肿瘤组织的caspase3蛋白表达细胞数较其它3组呈显著性升高(P<0.01),P27核内抑癌基因表达细胞数也较NS组明显增高(P<0.01),CD34染色标记测定的CD34及VEGF较NS组和Ad组明显减少(P<0.001),P53未见明显变化。结论Ad-hIL-24可以显著抑制裸鼠SMMC-7721荷瘤的生长,其机制可能通过激活caspase途径、上调P27抑癌基因表达、抑制血管形成等多途径发挥抑瘤作用。     

7-二氟甲氧基-5,4'-二正辛烷氧基金雀异黄素对人卵巢癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的:研究7-二氟甲氧基-5,4'-二正辛烷氧基金雀异黄素(7-difluoromethoxyl-5,4'-di-n-octylygenistein,DFOG)对人卵巢癌裸鼠移植瘤生长的影响。方法:建立人卵巢癌HO-8910细胞裸鼠皮下移植瘤,随机分为5组,每组5只,即生理盐水组(Saline),紫杉醇组(TAX),DFOG此处为3组(5、10、20 mg/kg)组,观察各组移植瘤的体积和重量变化,观察各组荷瘤裸鼠重量及其血清乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT)、肌酐值(Cr)、外周血白细胞计数(WBC)的变化。FCM检测移植瘤组织细胞的凋亡率,Western blot检测移植瘤组织细胞cortactin蛋白的表达变化。结果:DFOG各组显著抑制人卵巢癌HO-8910细胞裸鼠移植瘤生长,与Saline组比较,移植瘤体积明显减小(P均0.05),其中DFOG10mg/kg组对移植瘤抑制率与TAX组相当(P0.05);与Saline组比较,DFOG各组移植瘤重量明显减轻(P均0.05),其中DFOG10mg/kg组对移植瘤重量减少率与TAX组相当(P0.05)。与Saline组及DFOG各组比较,TAX组荷瘤裸鼠重量显著降低(P均0.05),而Saline组和DFOG各组之间荷瘤裸鼠重量比较差异无统计学意义(P0.05);与Saline组及DFOG各组比较,TAX组荷瘤裸鼠血清LDH、ALT、Cr值和外周血WBC计数显著降低(P均0.05),而Saline组与DFOG各组比较,荷瘤裸鼠血清LDH、ALT、Cr值和外周血WBC计数无明显差异(P0.05)。DFOG各组作用HO-8910细胞移植瘤16 d后,HO-8910细胞发生凋亡,与Saline组比较(P均0.05),其中DFOG10 mg/kg组凋亡率与TAX组相当(P0.05);同时cortactin蛋白表达降低,与Saline组比较(P均0.05),其中DFOG10 mg/kg组凋亡率与TAX组相当(P0.05)。结论:DFOG能抑制卵巢癌HO-8910细胞裸鼠移植瘤生长,下调cortactin蛋白表达和诱导HO-8910细胞凋亡。     

Increased sensitivity to cis-diamminedichloroplatinum induced apoptosis with mitochondrial DNA depletion

Malignant cells harbor mechanisms which allow escape from drug-induced apoptosis, and the drug-resistance phenotype can be significantly associated with resistance to programmed cell death. There is accumulating evidence that mitochondria play a role in the tumorigenic phenotype, including the relative resistance to apoptosis. Whether changes at the mitochondrial level per se, would impact on the relative sensitivity of malignant cells to undergo drug-induced apoptosis, is not know. Accordingly, we determined if depleting mitochondrial DNA (mtDNA) would change the susceptibility of U937 cells to undergo apoptosis. With depletion, increases in sensitivity to cis-diamminedichoroplatinum (cisplatin)-induced apoptosis was observed. This sensitivity could be reverted to the parental phenotype by transforming the depleted cells with normal platelet mitochondria. mRNA expression of BAX, BCL2, MDR1, MRP, ERCC1 and ERCC2, putatively associated with cisplatin resistance to apoptotic death was unchanged. Inhibition of mitochondrial ATP production by oligomycin did not result in a change in ATP levels, indicating energetics were not playing a role in the observed phenotype changes. All U937 cells (with/without mtDNA) continued to respond to cisplatin by an apoptotic death. MtDNA-encoded molecules may be playing a role in the relative sensitivity of cells to undergo a cisplatin-induced apoptotic death, but may not be required for cells to undergo apoptosis per se.     

10种ABC转运蛋白在鼻咽癌顺铂耐药细胞系中的表达

为研究鼻咽癌细胞CNE2中顺铂耐药与10种ABC转运蛋白的关系,分别用顺铂、顺铂+5-氟脲嘧啶来诱导CNE2耐药,在脱药培养2个月后通过MTT法测定细胞的生长曲线及其与顺铂的量效关系和耐药指数,同时,通过荧光定量PCR法检测耐药细胞与敏感细胞中10种ABC转运蛋白mRNA表达的差异,并通过免疫细胞化学法验证．MTT法结果提示,成功诱导出两株分别对顺铂、顺铂+5-氟脲嘧啶耐药的细胞株(分别命名为CNE2/DDP、CNE2/DDP+5Fu),耐药指数分别为2.58和5.31,ABCC2在两株耐药细胞株中表达均上调,分别为2.50和4.08倍,免疫细胞化学法结果表明,ABCC2在两株耐药细胞中表达均增强,同时ABCC2还可在CNE2/DDP+5Fu细胞核中表达．上述结果表明ABCC2在CNE2细胞对顺铂的耐药性中可能发挥着重要的作用．     

MiR-130a and MiR-374a Function as Novel Regulators of Cisplatin Resistance in Human Ovarian Cancer A2780 Cells

Chemoresistance remains a major obstacle to effective treatment in patients with ovarian cancer, and recently increasing evidences suggest that miRNAs are involved in drug-resistance. In this study, we investigated the role of miRNAs in regulating cisplatin resistance in ovarian cancer cell line and analyzed their possible mechanisms. We profiled miRNAs differentially expressed in cisplatin-resistant human ovarian cancer cell line A2780/DDP compared with parental A2780 cells using microarray. Four abnormally expressed miRNAs were selected (miR-146a,-130a, -374a and miR-182) for further studies. Their expression were verified by qRT-PCR. MiRNA mimics or inhibitor were transfected into A2780 and A2780/DDP cells and then drug sensitivity was analyzed by MTS array. RT-PCR and Western blot were carried out to examine the alteration of MDR1, PTEN gene expression. A total of 32 miRNAs were found to be differentially expressed in A2780/DDP cells. Among them, miR-146a was down-regulated and miR-130a,-374a,-182 were upregulated in A2780/DDP cells, which was verified by RT-PCR. MiR-130a and miR-374a mimics decreased the sensitivity of A2780 cells to cisplatin, reversely, their inhibitors could resensitize A2780/DDP cells. Furthermore, overexpression of miR-130a could increase the MDR1 mRNA and P-gp levels in A2780 and A2780/DDP cells, whereas knockdown of miR-130a could inhibit MDR1 gene expression and upregulate the PTEN protein expression .In a conclusion, the deregulation of miR-374a and miR-130a may be involved in the development and regulation of cisplatin resistance in ovarian cancer cells. This role of miR-130a may be achieved by regulating the MDR1 and PTEN gene expression.     

镉胁迫对金丝垂柳幼苗生长及叶绿素荧光特性的影响

采用盆栽试验的方法,研究土壤中不同浓度的镉(0、2、20、80 mg·kg-1)胁迫条件对金丝垂柳幼苗的生长、净光合速率(Pn)、光合色素含量及叶绿素荧光参数（Fv/Fm、φPsⅡ和qP）的影响.结果表明:(1)2 mg·kg-1处理组植物的生长、净光合速率及叶绿素荧光参数随着处理时间的增加呈先下降后上升的趋势,说明2...     

荭草种子萌发特性及幼苗部分营养成分研究

不同采收时期的荭草种子用98%浓硫酸处理3 min,10月份采收的种子发芽率最高;供试范围内,20℃~25℃变温条件下发芽率最高,黑暗中比光照中的发芽率高。子叶期的荭草幼苗和3片真叶期的荭草幼苗蛋白质质量分数分别为134.8mg.kg-1,152.5 mg.kg-1;Vc分别为89.1 mg.kg-1,187.0 mg.kg-1。     

姜黄素对顺铂所致胃组织ICC损伤的保护作用及机制

目的:探索顺铂对胃组织Cajal间质细胞(Cajal interstitial cells,ICCs)结构和功能的损伤以及姜黄素的保护作用。方法:选用成年雄性昆明种小鼠,随机分为对照组、顺铂组和顺铂+姜黄素组,每组各10只。姜黄素(200 mg/kg/d)混悬液连续灌胃15天。顺铂于实验结束前5天开始腹腔注射(2 mg/kg/d)共5天。计算每只小鼠最后5天的体重增减值,停药24 h后测量小鼠的胃排空率。电镜检测胃组织ICC超微结构,并测定特异性反映ICC功能变化的Ano1蛋白和m RNA的表达情况。结果:注射顺铂后各组小鼠的体重和胃排空率均显著降低(P0.01);与顺铂组相比,姜黄素预先灌胃组小鼠体重下降较少(P0.01),胃排空率有所回升(P0.05)。注射顺铂后,胃组织中ICCs受损,尤其与周围神经和肌肉间的缝隙连接增大甚至断裂,而姜黄素可以减轻这种损伤。同时,顺铂组胃组织中Ano1 m RNA和蛋白表达均下降(P0.01),加姜黄素组有所改善(P0.05)。结论:而姜黄素可通过减轻顺铂所致胃组织ICC结构损伤以及增强Ano1表达进而增强ICC慢波起博功能。     

楤木皂苷对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用

目的:观察楤木皂苷(total saponins extracted from Aralia taibaiensis,s AT)对大鼠心肌缺血/再灌注(myocardia1 ischemia/reperfusion,MI/R)损伤的影响。方法:可逆性冠脉左前降支结扎缺血30 min再灌注3 h复制MI/R模型,将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、s AT低、中、高剂量组,每组10只。采用伊文思蓝(EB)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑蓝(TTC)双染法测定心肌梗死面积,苏木精-伊红(HE)染色法观察心肌病理学形态变化,并检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平。结果:与模型组比较,s AT中、高剂量组可明显缩小心肌梗死面积(P0.05),并显著降低血清中LDH、CK-MB及MDA的含量,同时使得血清中SOD、CAT和GSH-Px的活性增加。且所有给药组心肌组织的病理损伤也小于模型组。结论:s AT对大鼠MI/R损伤具有保护作用,其机制可能与抗氧化作用相关。