北美鹅掌楸LtAGO1基因的克隆、表达及其启动子分析

为深入探究叶原基分化成叶器官的形态建成机制,该研究以北美鹅掌楸为材料,采用RT-PCR和RACE克隆技术获得LtAGO1的cDNA全长和启动子序列并预测其功能,通过RT-qPCR分析LtAGO1在鹅掌楸属中的组织表达模式。同时,经抗性筛选和DNA鉴定获得ProAGO1 ∷ GUS的转基因拟南芥株系,并进一步对T2代阳性植株进行表型和GUS组织化学染色分析。结果表明:(1) LtAGO1基因包含3 300 bp的开放阅读框,编码1 100个氨基酸,分子量为122.14 kD,理论等电点(pI)为9.36。(2)氨基酸序列分析显示LtAGO1含Gly-rich-AGO1和Piwi两个典型的AGO基因结构域,同源性分析显示LtAGO1蛋白与沉水樟AGO1蛋白(RWR84608.1)亲缘关系最近。(3)组织表达特异性分析显示LtAGO1在北美鹅掌楸不同组织间的相对表达量为雄蕊>花芽>花瓣>花萼>叶片>雌蕊>叶芽>茎,LtAGO1在北美鹅掌楸叶片不同发育阶段的相对表达量为叶芽萌动期>幼叶期>衰老期>成熟期,AGO1在鹅掌楸属叶缘的表达量高于叶片的其他部位且北美鹅掌楸叶凹陷部位的表达量高于叶尖部位。(4)获得叶中-侧轴向和基-顶轴向的极性缺失、叶缘锯齿、重瓣花型的转化株系,GUS组织染色显示ProAGO1启动GUS基因在叶芽顶端稳定表达且在新分化的叶柄上表达较强,在成熟期的茎、叶、花和果的维管束中均特异表达。LtAGO1启动子的GUS活性强度为叶顶芽>花>维管束,这与实时定量PCR结果相一致。综上认为,LtAGO1基因在顶端分生组织特异表达且受到多种途径的调控而参与到叶和花器官的发育进程中。该研究结果为进一步了解北美鹅掌楸LtAGO1基因的基本功能及其调控叶形发育机制提供了理论基础。     

miR-23b-3p通过靶向PDE4B基因调控山羊肌内前体脂肪细胞的分化

本研究旨在明确miR-23b-3p对山羊肌内前体脂肪细胞分化的影响，并确定这种作用是通过靶向基因PDE4B来实现的。基于实验室前期转录组测序结果，以筛选得到的山羊肌内脂肪细胞分化前后差异表达的miR-23b-3p为切入点，利用实时荧光定量PCR (real-time quantitative-polymerase chain reaction, qPCR)技术检测miR-23b-3p在山羊肌内前体脂肪细胞分化过程中的表达模式，从形态学水平和分子水平确定miR-23b-3p对脂肪分化及脂肪分化标志基因的影响；利用生物信息学预测以及双荧光素酶报告基因试验确定miR-23b-3p的下游靶基因，明确miR-23b-3p与预测靶标基因的靶向关系。结果表明，过表达miR-23b-3p后山羊肌内脂肪细胞脂滴积聚减少，成脂标志基因AP2、C/EBPα、FASN、LPL表达水平极显著下调(P＜0.01)，C/EBPβ、DGAT2、GLUT4和PPARγ的表达水平显著下调(P＜0.05)。干扰miR-23b-3p表达后，山羊肌内脂肪细胞中脂滴积聚增多，ACC、ATGL、AP2、DGAT2、GLUT4、FASN和SREBP1表达水平极显著上调(P＜0.01)，C/EBPβ、LPL和PPARγ的表达水平显著上调(P＜0.05)。通过生物信息学分析预测，PDE4B可能为miR-23b-3p的靶标基因，且过表达miR-23b-3p后极显著降低PDE4B的mRNA表达水平(P＜0.01)，干扰miR-23b-3p后PDE4B的mRNA水平得到了显著提升(P＜0.05)。双荧光素酶报告基因试验结果表明，miR-23b-3p与PDE4B基因存在靶向关系。miR-23b-3p通过靶向PDE4B基因调控山羊肌内前体脂肪细胞的分化。     

当归延伸因子AsEF 1β基因的克隆及胁迫应答分析

延伸因子1β(EF 1β)是蛋白质生物合成过程中肽链延长必需的调节因子之一。该研究采用同源克隆和RACE扩增技术克隆当归EF 1β基因序列,分析该基因序列特征、蛋白结构特点及UV B辐射胁迫下的组织响应表达,以揭示当归栽培生境变迁过程中对UV B胁迫适应的分子机制。结果显示：(1)成功克隆获得当归EF 1β基因全长序列(950 bp),编码225个氨基酸,命名为AsEF 1β(GenBank登录号：MG736314);AsEF 1β蛋白的分子量为24.5 kD,理论等电点为4.48,属亲水性氨基酸,在其C末端具有一个EF 1B超蛋白家族的典型结构域和保守区,鸟嘌呤核苷酸交换结构域;其氨基酸序列与同为伞形科的胡萝卜氨基酸序列相似性最高,达93%。(2)qRT PCR分析结果显示,AsEF 1β基因在当归根部的表达量显著高于茎和叶(P<0.05);UV B辐射胁迫下,茎及叶中的表达量均上调,分别是自然光照处理的2.43和3.76倍。研究表明,AsEF 1β基因可能参与当归对UV B辐射胁迫的适应过程,为深入研究其在药用植物生长发育、逆境抗性形成及药效物质的生物合成代谢过程的生态调控奠定了基础。     

不同代次牛成肌细胞的诱导分化及相关基因的表达分析

利用初生荷斯坦牛的成肌细胞,在不同代次以含体积分数为2%马血清的DMEM进行诱导分化,在之后0、2、4、6、8、10 d观察细胞的形态变化并收集细胞提取总RNA,检测成肌相关基因的表达情况,为进一步研究牛肌肉发生过程及相关基因的表达调控提供依据。同时利用实时荧光定量PCR分别检测肌性相关基因MyoD(生肌决定因子)、MyoG(肌细胞生成素)以及非肌性相关基因A-FABP(脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白)表达水平的变化。研究表明：①各代细胞在诱导培养4 d后开始有肌管形成,其后越来越多,8 d时达高峰。②成肌细胞向成熟肌细胞分化过程中,MyoD、MyoG、A-FABP基因都呈先上升然后下降的趋势。③高代次成肌细胞比低代次细胞增殖慢,而且在诱导分化后,肌管的数目明显变少; MyoD、MyoG、A-FABP随着代次的升高而下降。故推断MyoD、MyoG以及A-FABP基因会在成肌分化开始后的不同阶段被激活,从而发挥不同的调控作用,而且随着传代次数的增加成肌细胞的分化能力减弱。     

鹅源新城疫病毒NP、P和L基因的克隆与P基因的表达鉴定

将鹅源新城疫病毒的NP、P和L基因通过RT PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pGEM-Teasy载体 ,再分别亚克隆到真核表达载体pCI neo上 ,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确。利用P基因开放性阅读框 (ORF)上靠近终止密码上游的AgeI位点 ,将报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)基因克隆进P基因真核表达重组质粒 ,分别转染COS-1细胞和CEF细胞 ,在倒置荧光显微镜下可见到绿色荧光 ,表明GFP基因已得到表达 ,由此证明P相似文献   

pVA质粒中II型分泌系统同源基因对副溶血弧菌生物学特性及PirAB表达和分泌的影响

【背景】副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是引起养殖对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)的病原之一，毒素蛋白PirAB是该病原的致病因子，由病原携带的pVA质粒上的pirA和pirB编码。PirAB的分泌途径尚未明确。【目的】探究pVA质粒中Ⅱ型分泌系统同源基因epsG2和epsE2对副溶血弧菌生物学特性及PirAB表达和分泌的影响。【方法】通过生物信息学分析发现副溶血弧菌VP220218株pVA质粒上存在2个Ⅱ型分泌系统(type Ⅱ secretion system, T2SS)的同源基因epsG2和epsE2；利用框内缺失方法构建了突变株ΔepsG2和ΔepsE2，检测其生长、生物被膜形成、运动力和胞外蛋白酶活力的变化，进一步用RT-qPCR和Western blotting分析了PirAB表达和分泌的变化。【结果】epsG2和epsE2能够抑制VP220218的胞外蛋白酶活力(P<0.001)、在对数生长期抑制细菌的生长(P<0.05)；此外，epsG2能够促进细菌的运动(P<0.05)、在平台期抑制VP220218的生物膜形成(P<0.05)，epsE2能够抑制细菌的运动、在对数生长中后期促进VP220218的生物膜形成(P<0.05)。RT-qPCR结果显示，epsE2对pirA和pirB的表达无影响；epsG2在对数生长初期和中期抑制pirA和pirB的表达，在对数生长后期和平台期则促进pirA和pirB的表达。Western blotting结果显示，epsG2对PirAB的合成和分泌无影响，epsE2能够促进PirAB的合成和分泌。【结论】epsG2和epsE2参与了副溶血弧菌VP220218的生理活动，且epsE2影响PirAB的合成和分泌。研究结果为了解致AHPND菌PirAB毒素的合成和分泌途径提供了参考。     

番茄LeRma1基因的克隆与表达

以番茄‘哈大粉801’为试材,利用RT-PCR技术,克隆得到1个E3泛素蛋白连接酶基因LeRma1（GenBank登录号XM_004243764.1）。对LeRma1基因进行序列分析,并对LeRma1基因在番茄植株的不同部位以及在非生物胁迫（干旱、盐、碱、高温、低温）下的表达和生理特性进行研究,为培育和改良番茄品种提供理论依据。结果表明：（1）序列分析显示,LeRma1基因的cDNA全长序列729 bp,编码242个氨基酸,分子量为27.05 kD,理论pI 7.97;同源分析显示,番茄LeRma1蛋白与马铃薯的一致性最高（91%）。（2）半定量PCR检测表明, LeRma1基因在番茄根、茎、叶、花、果实中均有表达,且表达差异不明显。（3）干旱胁迫下,LeRma1基因在番茄叶片中优势表达,而在整个干旱过程中根部的LeRma1基因表达量变化不明显;抗旱相关基因LEA、 DREB2A、ABI3在干旱胁迫过程中,番茄叶片中均有表达,且其表达量呈上升趋势,而在根部DREB2A、ABI3基因基本没有检测到。（4）干旱胁迫过程中,番茄植株中丙二醛（MDA）含量呈显著升高趋势,质膜系统严重损伤,体内保护酶（SOD、POD、CAT）活性上升,且根部活性总体明显高于叶片。（5）在非生物逆境（盐、碱、高温、低温）胁迫过程中,LeRma1基因在番茄叶片和根部的表达几乎都有增强的趋势,且在叶片中均是胁迫3 h后诱导起始增强表达。研究认为,LeRma1基因是一个受干旱胁迫诱导增强表达的基因,且在叶片中优势表达,说明LeRma1基因对植物耐受干旱胁迫所起的作用存在一定的组织差异性,而且LeRma1基因可能参与番茄的干旱应答及信号转导过程,在番茄抵抗其他非生物胁迫中LeRma1基因也可能具有一定的作用。     

Knockdown of KLF9 promotes the differentiation of both intramuscular and subcutaneous preadipocytes in goat

ABSTRACT

KLF9 is reported to promote adipocyte differentiation in 3T3-L1 cells and pigs. However, the roles of KLF9 in adipocytes differentiation of goat remain unknown. In this study, the expression profiles of KLF9 were different between subcutaneous and intramuscular preadipocytes of goat during differentiation process. After silencing KLF9 gene, the lipid droplets were increased in both two types of adipocytes. In subcutaneous preadipocyte with silencing KLF9, the expressions of C/EBPβ, PPARγ, LPL, KLF1-2, KLF5, and KLF17 genes were up-regulated, while KLF12, KLF4, and KLF13 genes were down-regulated in expression level. In intramuscular preadipocyte, aP2, C/EBPα, KLF2-3, KLF5, and KLF7 gene were up-regulated, and Pref-1 gene was down-regulated. In addition, the binding sites of KLF9 existed in the promoters of aP2, C/EBPα, C/EBPβ, LPL and Pref-1. Taken together, KLF9 play a negative role in the differentiation of both intramuscular and subcutaneous preadipocytes in goats, but the functional mechanism may be different.     

Resistin Gene Expression in Human Adipocytes Is Not Related to Insulin Resistance

Objectives: Obesity is an important risk factor for the development of insulin resistance and type 2 diabetes. Recently, a newly described circulating hormone resistin, which is expressed primarily in adipocytes, has been shown to antagonize insulin action in mice. Resistin, therefore, has been suggested to play a role in the pathogenesis of insulin resistance. Research Methods and Procedures: We studied the expression of the resistin gene in primary cultured human adipocytes and preadipocytes. We also examined resistin gene expression in subcutaneous abdominal adipocytes in women (n = 24) over a wide range of body weight and insulin sensitivity. Results: Whereas resistin gene expression was barely detectable in mature adipocytes, it was highly expressed in preadipocytes. Adipogenic differentiation of preadipocytes was associated with a time-dependent down-regulation of resistin gene expression. There was no relationship between body weight, insulin sensitivity, or other metabolic parameters and adipocyte resistin gene expression in the clinical study. Discussion: Together these findings do not support an important role of adipose-tissue resistin gene expression in human insulin resistance.     

小桐子JcACBP基因克隆和序列分析

以小桐子(Jatropha curcas)cDNA为模板,克隆了酰基辅酶A结合蛋白(Acyl-CoA-binding Protein)基因(JcACBP)的CDS序列,对其序列进行了生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法,研究了JcACBP基因在小桐子不同器官和果实生长发育阶段的表达模式。结果显示:JcACBP基因完全阅读框(coding sequence,CDS)全长279bp,编码92个氨基酸。预测其编码蛋白质的分子量为10.30kD,具有ACBP家族典型的结构域。JcACBP基因推测氨基酸与油桐(Vernicia fordii,AFZ62125)的亲缘关系最近(96%)。JcACBP基因在小桐子根、茎、叶、花、发育中的胚及果实等组织中都有表达,其中在花后40d的种子中表达最高,其次是果皮,而在根中表达较少;在果实发育过程中的表达与果实油脂积累的变化趋势基本一致。     

金银花丙酮酸激酶基因的克隆与表达特性分析

采用RT-PCR和RACE技术,首次从金银花中克隆丙酮酸激酶基因全长cDNA,命名为LjPkc(GenBank登录号JQ621946.1),LjPkc基因编码区序列全长为1 533bp,共编码510个氨基酸。基于基因序列亲缘关系分析结果显示,LjPkc基因与烟草Pkc基因亲缘关系最近,属于双子叶植物Pkc基因家族。蛋白质亚细胞定位分析认为LjPkc在线粒体或叶绿体中发挥作用。LjPkc蛋白质的三维空间结构预测结果显示,LjPkc蛋白主要由α-螺旋、不规则盘绕组成。定量PCR检测发现,LjPkc基因在金银花不同组织中广泛表达,但表达水平各有差异,黄花中表达量最高。该研究丰富了Pkc基因库资源,为揭示LjPkc基因在金银花糖代谢方面的生物学作用奠定了基础。     

Depot specific differences during adipogenesis of porcine stromal-vascular cells

Recently a role of adipose tissue as an endocrine organ secreting factors involved in the regulation of whole-body energy homeostasis has emerged. Preadipocytes in different fat depots have distinct adipogenic potential and the metabolic activity differs between mature adipocytes of different depot origins. Here we describe the proliferation and differentiation of stromal-vascular cells derived from subcutaneous and visceral fat depots of adult pigs. We demonstrate that subcutaneous porcine preadipocytes proliferate more actively and that individual subcutaneous adipocytes have a more rapid accumulation of triacylglycerols than visceral cells. During differentiation, subcutaneous and visceral preadipocytes showed similar gene expression patterns with increased expression of adiponectin (APM1), adipocyte-specific fatty acid binding protein (FABP4), catalase (CAT), and peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARG2). Furthermore, initial data showing depot-originated effects on the expression of CAT, carnitine palmitoyl transferase 1B (CPT1B) and FABP4 suggest possible depot specific differences in the function and metabolism of mature porcine adipocytes.     

萝卜-芥蓝异源四倍体植物SR30基因转录本的选择性剪接分析

为了解异源多倍体形成后,其剪接因子基因SR30在各组织器官间的表达量以及选择性剪接模式与亲本的差异,选取萝卜-芥蓝异源四倍体(Raphanobrassica)及其亲本萝卜(Raphanus sativus)、芥蓝(Brassica oleracea var.alboglabra)为材料,运用RACE-PCR方法克隆到全长的编码序列(CDS)和3非编码区(3 UTR),运用q RT-PCR和半定量RT-PCR检测其在各组织器官中的表达量和各转录本表达量间的差异。结果表明,四倍体中萝卜同源的Rs SR30基因有5种转录本,芥蓝同源的Bo SR30基因有4种转录本。同时,SR30在3物种中的表达具有组织器官的差异,且在四倍体中的总体表达量显著低于亲本。根据克隆到的转录本,预测Rs SR30编码3种蛋白,Bo SR30编码2种,不同蛋白异构体的区别体现在C末端的丝氨酸-精氨酸富集(RS)结构域。因此,萝卜-芥蓝异源多倍体形成后,SR30基因在表达量和转录本选择性剪接方面都发生了改变。