用硫酸铵沉淀法从液体培养物中纯化噬菌体λDNA

噬菌体是近年来DNA克隆最常用的载体之一。因此高质量的λDNA的制备是DNA重组的一项关键性技术。所谓高质量的λDNA制品应不被宿主菌的DNA所污染,DNA链必需完整而不被折断成碎片,并能被工具酶所加工。迄今制备λDNA的方法的主要差别在于对噬菌体颗粒的纯化步骤并存在一些缺点:PEG沉淀结合CsCI梯度离心法费用大。得率低,而且费时,不适合于多个样品DNA的快速提纯。纤维素酶DE-52层析法的缺点是大量的溶菌物过柱后,DE-52会结块,而且要有多套层析设备。直接从PEG沉淀的噬菌体颗粒提取的DNA往往纯度不高,需要有亚精胺存在时才能被限制性内切酶所切割。1989年,Ziai等首先用(NH_4)_2SO_4从平板培养法制备的噬菌体溶菌物中沉淀λgtll颗粒。用RNase处理去除污染的宿主菌RNA后,先用蛋白酶K,再用NaOH处理使λ噬菌体颗粒裂解,再用酚抽     

影响λ噬菌体包装蛋白抽提物效价的因素

<正> 以λ噬菌体DNA作载体构建基因文库时,λ噬菌体包装蛋白抽提物是实验成败的关键之一,市场上虽有此商品出售,但由于价格昂贵加上运输和保藏方面的问题,使用时往往不够理想。所以,不少实验室自己制备噬菌体包装蛋白抽提物。任兆韵等报导:快速诱导可以提高包装效价,在这里我们报导包装反应时间等其他因素对λ噬菌体包装蛋白抽提物效价的影响。     

重离子射线照射后抗辐射菌基因组DNA的损伤修复

研究了不同种类的重离子射线及同一射线的不同剂量照射后引起的抗辐射菌(Deinococcus radiodu-rans)R1的DNA二条链的切断损伤修复时间。结果表明,抗辐射菌经重离子射线照射后所引起的DNA二条链的切断损伤经过培养能被修复;切断的DNA二条链的修复时间随着照射剂量的增加而延长;高LET的重离子射线照射所引起的损伤修复比低LET的重离子射线需要更长的时间,损伤修复的时间与射线的LET之间存在一定的依存性。由此认为:抗辐射菌经照射后引起的DNA二条链切断损伤与射线的种类及照射的剂量有关,照射的剂量越大,射线的LET越高,则DNA二条链的切断损伤越多,损伤修复所需要的时间越长。     

λ噬菌体及其在遗传工程中的应用(三)

五、DNA繁殖载体的设计由于对λ噬菌体的遗传学和生物化学进行了较为广泛、深入的研究,人们目前已能比较得心应手地将λ噬菌体作为基因移植的运载体。这是因为,在λDNA分子中,大约有1/3的片     

DNA连接酶及其应用

引言在六十年代后半期,从大肠杆菌及用T_4噬菌体感染的大肠杆菌中发现了DNA连接酶,它能起催化修复DNA双股链中单股断裂(缺口)的作用(图1)。以后不久,陆续在哺乳动物细胞、高等植物、Rous肉瘤病毒颗粒和带λ_(c_1)噬菌体的大肠杆菌中找到这种酶。它广泛存在于生物有机体中,而且很多特性都是近似的,有普遍的生物学意义,因而,对酶及其应用的研究     

λ噬菌体穿孔素(holin) 蛋白触发裂菌的分子机制

穿孔素-裂解酶二元裂解系统是双链DNA噬菌体普遍采用的裂菌模式,以λ噬菌体为例,系统地揭示了噬菌体穿孔素的结构与功能。λ噬菌体的S基因的特征是呈双起始基序(dual-start motif),编码穿孔素(holin)S105和抗穿孔素(antiholin)S107,通过二者不同水平的表达及相互作用,触发裂菌过程。作者综述了λ噬菌体穿孔素的膜拓扑结构和成孔机制的最新研究进展,并展望了穿孔素的研究热点和应用前景。     

利用平板法获得高效价λ噬菌体悬液

我们研究了在平板上获得高效价λ噬菌体的方法,并将平板增殖的高效价λ噬菌体用于λDNA的简易制备。材料与方法1.菌株:λ噬菌体用E.Coli w1485(cI85757)经热诱导获得;指示菌为E.Coli 266 YMC Lac~-。由中国科学院微生物研究所提供。2.培养基:(1)BPY培养基:用于斜面     

产生志贺样毒素的噬菌体ψ297整合酶基因(int) 的克隆和序列分析

目的克隆并分析细菌性噬菌体ψ297的整合酶基因(int).方法采用加接头的基因DNA片断为模板进行步移PCR,根据溶源性噬菌体ψ297的染色体DNA上类似于噬菌体933W的整合酶基因的一个40个核苷酸设计引物,进行扩增、克隆、亚克隆、测序和序列分析.结果得到了噬菌体ψ297编码的整合酶基因(int)的完整序列,它的长度是1287bp,编码了428个氨基酸的Int蛋白质.将它们的序列与λ噬菌体的整合酶家族其它成员进行了比较,发现噬菌体ψ297的整合酶基因(int)与噬菌体VT1-Sakai的整合酶基因有79%的同源性,噬菌体ψ297的Int蛋白与噬菌体VT1-Sakai的Int蛋白在氨基酸序列上有82%的同源性.N-末端的氨基酸区域是完全保守的,而中心区和C-末端则显示出较大差异.结论噬菌体ψ297与λ噬菌体的int基因来源于同一基因库,噬菌体ψ297可能属于λ噬菌体家族.     

RNA修复研究进展

机体DNA损伤修复的机制目前已研究得比较全面,而RNA损伤修复的研究却没有引起广泛的认识.主要由于人们长期以来认为损伤的RNA会被机体特异性降解而不是修复.近年来,随着多个RNA损伤修复系统的相继发现,揭示机体对损伤RNA可能优先选择进行修复.本文从噬菌体型RNA修复系统、细菌型RNA修复系统、酵母型RNA修复系统和人类的RNA损伤修复系统四个方面对目前RNA损伤修复研究的最新进展做一综述.     

产生志贺样毒素的噬菌体φ297整合酶基因（int）的克隆和序列分析

目的：克隆并分析细菌性噬菌体φ97的整合酶基因(int)。方法：采用加接头的基因DNA片断为模板进行步移PCR,根据溶源性噬菌体φ297的染色体DNA上类似于噬菌体933W的整合酶基因的一个40个核苷酸设计引物,进行扩增、克隆、亚克隆、测序和序列分析。结果：得到了噬菌体φ297编码的整合酶基因(int)的完整序列,它的长度是1287bp,编码了428个氨基酸的Int蛋白质。将它们的序列与λ噬菌体的整合酶家族其它成员进行了比较,发现噬菌体φ297的整合酶基因(int)与噬菌体VT1-Sakai的整合酶基因有79％的同源性,噬菌体φ297的Int蛋白与噬菌体VT1-Sakai的Int蛋白在氨基酸序列上有82％的同源性。N-末端的氨基酸区域是完全保守的,而中心区和C-末端则显示出较大差异。结论：噬菌体φ297与λ噬菌体的int基因来源于同一基因库,噬菌体φ297可能属于λ噬菌体家族。     

染色质改构因子BRG1降低UV照射引起的细胞凋亡

生命体的遗传物质基础是DNA分子,多种因素可以作用于细胞内的DNA分子,导致多种类型的DNA损伤。若受损的DNA得不到及时和有效的修复,细胞将走向凋亡或发生变异。染色质改构复合物(chromatin remodeling complex)在基因表达调控和DNA复制等方面扮演着重要角色。依赖ATP的染色质改构复合物SWI/SNF的核心亚基Brahma Related Gene1(BRG1)在染色质结构调整和基因转录调控等多个细胞进程中具有重要作用,仅有有限的文献报道BRG1参与到DNA的损伤修复过程。因此,进一步研究与验证BRG1在调控DNA的损伤修复进而挽救细胞凋亡中的作用十分重要。本文通过利用不同强度的UV照射检测细胞凋亡的情况,初步建立了DNA损伤修复的实验体系。将BRG1表达质粒瞬时转染到SW13(BRG1-/-)细胞系中,并利用30J/m2的UV照射,分别在0h、6h和24h检测细胞早期凋亡程度。结果表明,SW13(BRG1-/-)细胞中瞬时表达BRG1可以明显降低由UV照射引起的细胞凋亡,其中UV照射后24h的细胞表现最明显。我们进一步在HeLa细胞中通过瞬时表达BRG1验证了上述结果。由于BRG1通过染色质改构在基因的转录调控、复制和重组等方面起着重要的作用,我们推测BRG1可能通过染色质改构参与了DNA的损伤修复过程,进而影响了细胞凋亡。     

地衣芽孢杆菌的温和性噬菌体——Ⅱ.DNA分子生物学特性的研究

增殖Blp7、Blp11、Blp16这一类群噬菌体并抽提其DNA,用电镜法测定噬菌体DNA长度为62.75±1.47 kb,并证实它们与λ噬菌体相似,含有一个能使DNA环化的粘性末端。DNA经碱部分变性后,电镜观察可以识别Blp 7 DNA分子的R端与L端。用限制性内切酶EcoR1、BamHI酶切Blp7及Blp16 DNA,经琼脂糖凝胶电泳后,观察到DNA分子的多态性。     

DNA损伤修复过程表观遗传学改变

多种化学、物理及生物因素可诱发细胞DNA损伤,损伤后DNA损伤位点被相关损伤感受器识别,激活相应的修复通路进行DNA修复。越来越多的证据表明DNA甲基化状态、蛋白翻译后修饰、染色质重塑、miRNA等修饰方式参与了DNA的损伤修复。文章通过不同损伤修复通路中这些修饰的特点,阐述表观遗传学改变在DNA损伤修复发展过程中的作用机制。     

遗传工程中的一种新型载体——科斯质粒(cosmid)

美国的Collins等人近年来研制了一种称为科斯质粒(cosmid)的新型基因载体,它是带有λ噬菌体cos位点的质粒。λ噬菌体的环状DNA易于自发地在某一个特定的位点断裂,成为线状分子。断裂的两端由于存在互补的核苷     

Rad9在DNA损伤修复及细胞周期检测点调控中的作用

细胞时刻面临着细胞内部因素或周围环境因素对基因组DNA的攻击,从而导致DNA损伤。DNA损伤可触发生物的DNA损伤修复系统来管理和修复各种DNA损伤,以维持基因组稳定性。当细胞受到损伤后,Rad9在细胞周期检测点中发挥作用,阻滞细胞周期的运行,使细胞有时间修复损伤DNA,来维持基因组的稳定。本文重点介绍Rad9在DNA损伤修复及细胞周期检测点调控中的作用及研究进展。     

λ噬菌体及其在遗传工程中的应用(二)

四、λDNA的基因与基因功能在作λ遗传学分析的时候,一种方法是利用突变体可查觉的异常来明确基因的功能和排列;另一种方法通过原噬菌体缺失,转导噬菌体及品系间杂交来排列遗传位点的次序。为了说明这个问题,分两个方面介绍,一个是λ的突变体,另一个是染色体的畸变。 (一)突变体 1.噬斑类型突变体人们首先注意到的λ突变是引起噬斑形态     

一个实用的制备EMBL4 DNA 的方法

以往人们通常用氯化铯梯度超速离心法、甘油梯度超速度离心法等方法纯化噬菌体。采用这些方法,虽然可以获得纯净的λ噬菌体颗粒。但需要昂贵的试剂和仪器。操作也冗长繁琐。我们采用并改进了Reddy的方法,首先用DE_(52)纤维素柱层析纯化λ噬菌体颗粒,然后用酚抽提,从提纯的噬菌体中分离DNA,这个方法简单快速,不需要氯化铯梯度超速离心,也不使用SDS、蛋白酶和核酸酶。     

D-环丝氨酸浓缩重组质粒菌优选条件的研究

体外DNA重组技术是分子遗传学研究的有力工具。近年来,国内外已经报道了包括原核和真核基因组中DNA片段无性繁殖的许多有意义的实验。1976年Bernardi等利用限制性核酸内切酶EcoRI及粘着末端连接法,将λ噬菌体DNA片段与pSC101质粒在体外建成了含有所有λ-EcoRI片段的重组DNA,并在     

噬菌体Ψ297切除酶(xis)基因的克隆和序列分析

目的：克隆噬菌体ψ297切除酶(xis)基因,并对其进行遗传与变异研究。方法：提取埃希氏大肠杆菌O157：H7菌株EH297染色体DNA,采用步移PCR方法寻找目的基因,并通过克隆、亚克隆、DNA测序等分子生物学方法获得切除酶基因,通过序列分析软件对此基因进行分析。结果：克隆获得噬菌体ψ97编码的切除酶基因(xis)的完整序列,它的长度是255bp,编码了一个84个氨基酸组成的蛋白质(xis),将它们的序列与λ噬菌体的切除酶家族的其它成员进行了比较。其结果是噬菌体ψ297的切除酶基因(xis)与噬菌体VT1-Sakai的切除酶基因(xis)只有4个核苷酸的不同,而Xis蛋白与噬菌体VT1-Sakai的Xis蛋白是一样的,与噬菌体933W的Xis蛋白只有47．2％的相似性。结论：噬菌体ψ297编码的切除酶基因(xis)与λ噬菌体的切除酶基因同源。     

噬菌体φ297切除酶(xis)基因的克隆和序列分析

目的:克隆噬菌体φ297 切除酶(xis)基因,并对其进行遗传与变异研究。方法:提取埃希氏大肠杆菌O157:H7 菌株EH297染色体DNA,采用步移PCR方法寻找目的基因,并通过克隆、亚克隆、DNA测序等分子生物学方法获得切除酶基因,通过序列分析软件对此基因进行分析。结果:克隆获得噬菌体φ297编码的切除酶基因(xis)的完整序列,它的长度是255 bp,编码了一个84个氨基酸组成的蛋白质(Xis),将它们的序列与λ噬菌体的切除酶家族的其它成员进行了比较。其结果是噬菌体φ297的切除酶基因(xis)与噬菌体VT1-Sakai的切除酶基因(xis)只有4个核苷酸的不同,而Xis蛋白与噬菌体VT1-Sakai的Xis蛋白是一样的,与噬菌体933W的Xis蛋白只有47.2%的相似性。结论:噬菌体φ297编码的切除酶基因(xis)与λ噬菌体的切除酶基因同源。