黄河鲤性别决定时间和相关基因表达研究

鱼类性别决定和分化机制极为复杂,通过性腺组织切片鉴定得出黄河鲤从未分化性腺发育为Ⅱ期精巢、卵巢的时间为受精后第40天到第80天。选取一些可能参与黄河鲤性别决定分化相关的基因（amh、ar、cyp19a、cyp19b、dax1、dmrt1、er、foxl2、nobox、sox9a、sox9b、zp2）进行实时荧光定量PCR分析各个基因在受精后40d、45d、50d、55d、65d和80d的表达情况。结果显示性别决定相关基因在50d都有高表达,推测45-50 d为性别决定的关键时间。ar、amh、dax1、dmrt1、sox9a、sox9b六个基因在80d雄性表达量升高,且雄性明显高于雌性,推测这些基因参与精巢分化发育过程。cyp19a、cyp19b、foxl2、nobox、zp2五个基因在80d雌性表达升高,且高于雄性,推测其可能参与卵巢分化发育。     

17β-雌二醇对斑马鱼性别分化的影响

有报道表明,经17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)处理后,斑马鱼种群中雌性比例上升。为了研究E2雌性化作用的机制,选取一系列斑马鱼体内与性别分化有关的基因(brca2,sox9a,sox9b,dmrt1和cyp19a1a),采用q RT-PCR分析它们在不同的处理条件下表达水平的变化。结果表明,E2能上调雌性相关基因(brca2、sox9b)的表达,下调部分雄性相关基因(sox9a)的表达,对不同发育阶段的斑马鱼体内的性激素转化通路(cyp19a1a)的影响不同。     

光周期对许氏平鲉性腺分化过程中形态学、性激素水平及相关基因表达的影响

研究以35日龄(dpb)许氏平鲉(Sebastes schlegelii)仔稚鱼为对象, 研究不同光周期(短光照组L﹕D=8﹕16、长光照组L﹕D=16﹕8和对照组L﹕D=12﹕12)对性别分化、相关激素水平及基因表达水平的影响。结果显示非自然的光周期尤其是较短的光照, 会不同程度地影响性腺分化时期性腺发育程度, 并且短光照会导致部分性腺雄性化; 雌激素(E₂)在短光照组中更早出现峰值, 而雄激素(T)在3个处理组中均在实验第9天时达到峰值; 4个卵巢分化相关基因cyp19a1a、ERα、ERβ2和foxl2中, ERα、ERβ2和foxl2受短光照影响显著, 实验中后期出现明显的抑制(P<0.05); 4个精巢发育相关基因sox3、sox9、amh和dmrt1相对表达水平未见明显规律, 可能与精巢分化时间较晚有关。综合而言, 较短的光照会影响性腺的发育以及性腺的分化, 抑制卵巢分化基因的表达, 诱导原始性腺雄性化。     

Smad2/3a对斑马鱼神经嵴细胞标记基因crestin表达的影响

目的 探讨Smad2/3a对脊椎动物神经嵴细胞发育的影响。方法 通过在斑马鱼胚胎单细胞时期显微注射smad2/3吗啉环修饰的反义寡核苷酸的方法,特异性敲降smad2/3基因的表达,至胚胎发育至6体节,利用整胚原位杂交检测神经嵴细胞特异性标记基因snail1b,sox10,foxd3和crestin的表达情况;通过casmad2 mRNA和smad3a mRNA显微注射的方法过表达smad2和smad3a,同样利用整胚原位杂交检测神经嵴细胞特异性标记基因crestin的表达情况;通过过表达casmad2及smad3a对下调smad2和smad3a的胚胎进行挽救。结果 smad2/3a被敲低后,crestin的表达量显著降低,而snail1b,sox10和foxd3的表达量无明显变化。smad3b被敲低后,crestin,snail1b,sox10和foxd3的表达量均无明显变化;过表达casmad2和smad3a均可导致crestin的表达量增高;过表达casmad2和smad3a可挽救由于smad2/3a敲降所造成crestin的低表达量。结论 Smad2和Smad3a对神经嵴细胞标记基因crestin的表达具有重要作用。     

牛sox2基因的克隆及重组反转录病毒载体的构建

为了构建包含牛sox2基因编码序列的重组反转录病毒载体,获得有感染性的病毒颗粒,本研究以胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR方法克隆出牛sox2基因的开放阅读框序列,将其亚克隆至pMD18-T载体并测序。结果表明获得的基因片段与发表的牛sox2基因序列(Gen Bank Accession No.NM-001105463)高度同源;将测序正确的重组T载体用EcoRI和BglII酶切,基因片段插入反转录病毒载体pMSCVneo的相同酶切位点,成功构建了重组反转录病毒载体pMSCV-sox2。采用脂质体法用pMSCV-sox2转染包装细胞PT67,同时用pMIG(含绿色荧光蛋白)作为阳性对照,经流式细胞仪测定,该载体转染效率达到68.3%;转染后PT67细胞经G418筛选得到稳定的产毒细胞株,其病毒滴度达8.16×107CFU/mL,为下一步特定因子诱导牛体细胞转变为牛iPS细胞的研究奠定了基础。     

Nodal信号靶基因dusp4抑制斑马鱼中内胚层形成

丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-2(MKP-2/DUSP4)具有酪氨酸磷酸酶和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性, 可以作用于MAPKs(Mitogen-activated protein kinases)底物, 使其去磷酸化。但dusp4在脊椎动物胚胎发育中的功能还所知甚少。为深入了解dusp4在发育中的作用, 文章首先检测了其在斑马鱼胚胎的表达。通过整胚原位杂交实验, 发现dusp4是斑马鱼母源表达的基因, 并且随着发育的进行, 在原肠早期特异表达在中内胚层区域。进一步的实验表明, Nodal信号对dusp4的表达至关重要。过表达Nodal信号的配体sqt、dusp4的表达水平明显升高, 而在缺失Nodal信号的突变体MZoep中, 几乎检测不到dusp4的表达。此外, 文章利用反义核苷酸Morpholino (MO)敲降dusp4的表达, 中内胚层标识基因gsc、sox17和sox32的表达水平显著升高, 而过表达dusp4对中内胚层的形成没有明显的影响, 表明dusp4对中内胚层形成的抑制作用是必需的, 但不是充分的, 可能还有其他未被鉴定的协同作用因子。以上研究结果表明, dusp4基因的表达受到Nodal信号调控, 在原肠期具有抑制中内胚层形成的作用。     

Sox9治疗兔椎间盘退变的效果及机制研究

目的:探究Sox9用于治疗椎间盘退变的效果及调控机制。方法:将Ad-sox9和Ad-GFP各20μL分别转染至椎间盘退变兔的髓核组织中,转染后3、7、30、60天取材,采用免疫组化、免疫荧光和MRI等研究方法检测椎间盘髓核组织中II型胶原、蛋白多糖的表达情况,并分析对椎间盘退变的改善情况。结果:免疫组化染色显示sox9组中椎间盘髓核组织中II型胶原、蛋白多糖的表达明显升高,MRI显示sox9组椎间盘T2像信号有明显改善(P<0.05)。结论:体内转染腺病毒介导的sox9基因能够增加椎间盘内II型胶原和蛋白多糖的表达,并抑制椎间盘的退变进程。     

染色质调节元件与不同启动子的相互作用对基因表达调控的影响

为探究DNA序列元件对不同启动子调节转基因稳定表达的影响,利用遍在染色质开放元件 (Ubiquitous chromatin opening elements,UCOE) 和基质黏附序列 (Scaffold/matrix-attachment regions,MAR) 分别与含增强子的oct4基因启动子、含CpG岛的sox2基因启动子和不含调控元件的nanog基因启动子以及同时包含增强子和CpG岛的CMV启动子组合构建pOCT4-MAR、pOCT4-UCOE、pSOX2-MAR、pSOX2-UCOE、pNANOG-MAR、pNANOG-UCOE、pCMV-UCOE、pCMV-MAR等质粒,分析这些质粒稳定转染后的表达量和嵌合表达差异。结果发现,UCOE与含增强子元件的oct4启动子组合能较稳定高效表达,而MAR与含CpG岛的sox2启动子组合能较稳定高效表达。利用排除位置效应原因的嵌合表达对染色质高级结构调控基因表达的稳定性分析表明：(1) 通常情况下UCOE比MAR调节的表达载体的表达更高效和更稳定;UCOE连接含CpG岛的启动子形成开放染色质调节的高表达更稳定;(2) MAR与启动子上TATA盒或增强子可能通过染色质环产生高表达,但相对不稳定。结论：染色质调节元件UCOE和MAR与启动子调控元件之间能通过染色质开放状态或染色质环调控基因稳定表达。     

miRNA对C3H10T1/2细胞成软骨分化相关基因表达的影响

目的探讨miR-30c-5p介导的C3H10T1/2细胞成软骨分化相关基因表达的影响。方法取C3H10T1/2细胞系并转染miR-30c-5p后,RT-qPCR验证miR-30c-5p相关的成软骨基因。结果转染miR-30c-5p诱导第7、14、21天时,RT-qPCR检测软骨标志物acan、sox9、col2a1mRNA的基因表达均显著高于对照组和过表达组。结论抑制表达阳性组的miR-30c-5p促进了C3H10T1/2细胞的成软骨基因的表达。