端粒酶RNA亚基模板突变抑制HeLa肿瘤细胞的生长

在端粒酶阳性的肿瘤细胞中引入带突变模板的人端粒酶RNA亚基（MT-hTR）是一种新颖的抑 制肿瘤细胞生长的方法.本研究通过构建MT-hTR真核表达重组体,初步观察其对人宫颈癌He La细胞生长的影响.通过分子克隆技术及PCR介导的定点突变技术构建野生型及突变型hTR表 达重组体,将空载体及重组体分别与质粒pEGFP-C1通过脂质体共转染HeLa细胞,经药物G418的筛选得到稳定表达外源基因的细胞.RT-PCR检测目的基因的表达,TRAP分析细胞的端粒酶活性,并通过MTT法绘制各组细胞的生长曲线.结果发现,重组体在细胞内能成功表达目的基因,并且在Mutant1转染细胞中检测到相应的突变型端粒酶活性.构建的4个MT-hTR重组体中,有3个能使HeLa细胞生长速度减缓.以上结果提示,在HeLa细胞内表达MT-hTR能抑制细胞的生长速度,并且突变模板的设计可能会影响到抑制效应的发挥.     

利用载体介导小干扰RNA诱导RSRC1基因沉默

目的：设计并构建人RSRC1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人RSRC1基因的cDNA序列为靶标,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,并将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒,测序正确后将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过Western blot和荧光分析检测其抑制效果。结果：重组体测序成功后,Western blot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性RSRC1表达;将siRNA重组质粒和带GFP标签的RSRC1共转染293T细胞,荧光显微镜下GFP的亮度明显减弱。结论：获得了2条人RSRC1siRNA真核表达载体,均能有效地抑制RSRC1基因表达。     

GLT-1基因siRNA真核表达载体的构建及其在大鼠神经胶质细胞中的抑制效应

目的:研究特异性siRNA对大鼠神经胶质细胞中GLT-1基因的阻抑效果。方法:根据GLT-1基因的序列特点和RNAi设计原则,设计其shRNA的核苷酸片段。退火后将其克隆入pSupressorNeo,构建可表达大鼠GLT-1基因siRNA的重组真核表达质粒pSuppressorNeo-GLT-1;利用脂质体法将其转染神经胶质细胞后,用RT-PCR、Western印迹及免疫荧光法等方法检测转染的神经胶质细胞中GLT-1基因的表达水平。结果:瞬时转染的神经胶质细胞中GLT-1基因的表达受到明显抑制,GLT-1蛋白含量明显下降。结论:pSuppressor-Neo-GLT-1质粒构建成功,瞬时转染神经胶质细胞后可以明显抑制GLT-1基因的表达。     

人Polo样激酶1基因的克隆表达及其影响c-Abl表达水平功能的初探

目的:克隆并在293细胞中表达人Polo样激酶1(Plk1)基因,探索Plk1对非受体型酪氨酸激酶c-Abl表达水平的影响。方法:利用PCR法扩增Plk1基因,分别定向克隆至pcDNA3-Flag及pCMV-Myc真核表达载体,将上述质粒分别转染293细胞进行瞬时表达,Western印迹检测Plk1蛋白的表达;将上述质粒分别与c-Abl表达质粒共转293细胞,检测带有不同标签的Flag-Plk1或Myc-Plk1对细胞中c-Abl激酶表达的影响。结果:构建了Flag-Plk1和Myc-Plk1真核表达质粒,其在293细胞中均可表达,蛋白的相对分子质量为68×103;与其共转的c-Abl激酶表达水平显著下调。结论:在293细胞中表达了Flag-Plk1和Myc-Plk1蛋白,且初步发现Plk1可以抑制c-Abl的表达。     

人eya2基因小干扰RNA表达载体的构建及表达

目的：设计并构建人eya2（eyes absent2）基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人eya2为靶基因,以pSliencer2．1-U6 neo质粒为载体,根据人eya2的cDNA序列,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;转化大肠杆菌DH5Ⅸ菌株,抽提质粒,测序分析;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过荧光分析、Westemblot和转录活性实验检测其抑制效果。结果：重组体测序结果与目的序列相一致,证明构建了eya2 siRNA真核表达载体;荧光观察表明siRNA能显著减弱细胞中绿色荧光强度,抑制eya2基因表达;Westemblot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性eya2基因表达;转录活性测定表明,构建的siRNA能有效抑制eya2基因表达。结论：构建了eya2 siRNA真核表达载体,该siRNA能有效地抑制eya2基因表达。     

利用靶定基质蛋白基因m的小干扰RNA抑制2009甲型H1N1流感病毒的复制

目的:设计、构建并筛选针对流感病毒基质蛋白基因m的小干扰RNA(siRNA),检测其对2009甲型H1N1流感病毒复制的抑制效果。方法:设计3条针对流感病毒m基因的siRNA,并克隆到短发夹型(shRNA)siRNA表达载体pSilencer2.1-U6-hygro上;经测序证明构建成功后,将表达3种siRNA的质粒和阴性对照质粒psiRNA-control分别转染MDCK细胞,用潮霉素筛选稳定表达细胞株,用H1N1流感病毒感染细胞,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果。结果:构建了3个针对流感病毒m基因的siRNA表达质粒,3种siRNA均使m基因的mRNA水平降低,其中M1-306的抑制效率达60%;3种siRNA均使流感病毒NA蛋白的表达量降低,M2-25、M1-105的抑制效率明显,M1-306略低。结论:针对m基因的siRNA可以有效抑制流感病毒在MDCK细胞中的复制。     

靶向端粒酶逆转录酶（hTERT）RNAi载体的构建及活性评价

RNA干涉是由与特定基因同源互补的双链RNA,在体内以序列特异的方式引发靶基因的mRNA降解,从而导致转录后基因沉默的过程.为研究内源性的siRNA对靶基因的抑制效果,用pPUR/U6载体构建用于细胞内转录靶向hTERT基因的短发夹状siRNA表达质粒,并评价其对hTERT基因的抑制效果.将hTERT cDNA 3 565～3 583一段19 bp的DNA序列及其反向重复序列,用9 bp的连接序列连接后再接上5个T碱基,将此段DNA序列克隆至pPUR/U6载体U6启动子的下游,形成能在体内合成hTERT特异性短发夹状RNA的重组质粒载体pPUR/U6/hTERT.将pPUR/U6/hTERT与对照质粒pPUR/U6分别转染HepG2细胞.采用嘌呤霉素筛选和富集转染具有抗性的细胞.收集存活的细胞接种12孔板、提取RNA和蛋白质.以细胞计数法测定细胞的生长速度,RT-PCR和蛋白质印迹分析hTERT基因的表达,端粒重复放大测定法检测端粒酶活性,蛋白质印迹检测p53蛋白水平.与转染对照质粒pPUR/U6的细胞相比,转染pPUR/U6/hTERT的细胞其hTERT基因表达水平显著下降,端粒酶活性降低,细胞生长速度变慢,p53蛋白表达明显升高.以上结果表明,以DNA质粒为载体产生的内源性短发夹状siRNA能高效抑制hTERT基因的表达,有望成为基因功能研究的有力工具.     

抑制人cFLIP 基因表达的shRNA 质粒的构建与功能验证

目的:构建特异性抑制cFLIP基因表达的质粒并检测其对肝癌细胞的影响。方法:根据人cFLIP mRNA的序列,设计合成3对cFLIP基因的shRNA,将其连入干扰载体,转染HepG2,蛋白印迹法检测基因表达情况,以检测其对肝癌细胞的影响。结果:构建了特异性抑制肝癌细胞中cFLIP表达的质粒。结论:成功构建能特异且高效阻断cFLIP表达的shRNA表达质粒,为进一步研究cFLIP基因对肝癌增殖的影响及其临床应用奠定了基础。     

应用载体介导的RNAi技术抑制胰腺癌细胞K-RASAsn12的表达

为了研究载体介导的RNAi（RNAinterference）技术特异地抑制K-RASAsn12。（K-RAS第12位密码子突变形式为GAT）在胰腺癌细胞中的表达,合成两条编码针对K-RASAsn12。突变特异性短发夹RNA（shorthairpinRNA,shRNA）序列的单链DNA,并将其克隆到pSilenCircle栽体中,构建含目的基因片段的重组质粒pSC-K-RASAsn12。同法构建含GFP基因片断的重组质粒pSC-GFP做为对照。用其分别瞬时转染人胰腺癌AsPC-1细胞和BxPC-3细胞后,经半定量RT-PCR和Westernblot检测K-RAS的表达水平。结果表明构建的针对K-RASAsn12的编码突变特异性shRNA的质粒表达载体可特异的抑制胰腺癌细胞的K-RASAsn12。表达,但对野生型的K-RAS（K-RASwT）表达无影响。     

利用RNA干扰抑制细丝蛋白A基因的表达

目的：构建细丝蛋白A（FLNa）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,并观察其对FLNa基因表达的抑制作用。方法：利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成1条针对FLNa的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer4．1-CMV-hygro中;将重组质粒pSilencer-FLNa、pSilencer-negative（阴性对照）转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检测FLNa的表达;通过潮霉素筛选建立干扰FLNa表达的前列腺癌细胞。结果：PCR鉴定证明构建了FLNa基因RNAi载体;Western印迹表明构建的FLNa基因干扰载体能够有效地抑制FLNa基因的表达;建立了稳定干扰FLNa表达的前列腺癌C4-2细胞。结论：构建了FLNa基因RNAi载体,该载体能够有效地抑制FLNa基因的表达。     

端粒酶反义cDNA对乳腺癌细胞损伤修复能力的影响

 利用反义核酸技术将端粒酶RNA的全长cDNA反向导入乳腺癌MCF 7细胞基因组中 .通过单细胞凝胶电泳实验发现 ,其DNA受H2 O2 损伤后的修复能力下降 .但端粒酶活性抑制为何引起其DNA损伤修复能力下降的原因尚待进一步研究 .     

端粒酶反义cDNA对乳腺癌细胞恶性表型的影响

 为了进一步探讨端粒酶在肿瘤发生中的作用 ,实验应用反义核酸技术研究端粒酶反义cDNA对乳腺癌细胞MCF 7恶性表型的影响 采用的方法包括 :基因重组、脂质体共转染法获得端粒酶反义重组病毒 ,病毒感染MCF 7后 ,检测细胞的生长曲线、细胞周期及集落形成能力 结果表明 ,与对照组细胞相比 ,反义病毒感染后的MCF 7细胞恶性表型明显降低 提示端粒酶RNA的反义cDNA的导入 ,可以显著抑制乳腺癌细胞恶性表型     

端粒酶RNA的反义cDNA对乳腺癌细胞凋亡的影响(英文)

 为了进一步探讨端粒酶RNA(hTR)的反义cDNA对乳腺癌MCF 7细胞凋亡可诱导性的影响 ,构建了能将外源基因整合至细胞基因组的整合型腺病毒载体vAd AAV ,并将hTR全长cDNA反向连接至此载体上 ,获得反义重组腺病毒vAdT AAV .vAd AAV和vAdT AAV分别感染MCF 7细胞后 ,获得两个细胞株MCF 7 vAd AAV和MCF 7 vAdT AAV ,其中MCF 7 vAdT AAV细胞基因组内整合有hTR反义cDNA并能稳定表达 .利用生存曲线、细胞形态学观察、DNA片段分析和流式细胞分析来测定NaBu和无血清DMEM诱导后细胞凋亡的反应性 .通过生存曲线 ,发现NaBu诱导的MCF 7 vAdT AAV细胞比对照组MCF 7和MCF 7 vAd AAV细胞更早出现凋亡 .电镜下 ,NaBu或去血清诱导的MCF 7 vAdT AAV细胞更早出现凋亡形态学指标 .流式细胞分析和DNA片段凝胶电泳实验均显示MCF 7 vAdT AAV细胞对凋亡的抵抗力下降 .研究结果表明 ,端粒酶RNA的反义cDNA使乳腺癌MCF 7细胞的凋亡可诱导性增强     

Inhibition of telomerase in tumor cells by ribozyme targeting telomerase RNA component

Telomerase plays an important role in cell proliferation and carcinogenesis and is believed to be a good target for anti-cancer drugs. Elimination of template function of telomerase RNA may repress the telomerase activity. A hammer-headed ribozyme (telomerase ribozyme, te-loRZ) directed against the RNA component of human telomerase (hTR) was designed and synthesized. TeloRZ showed a specific cleavage activity against the hTR. The cleavage efficacy reached 60%. A eukaryotic expression plasmid containing teloRZ gene was inducted into HeLa cells by lipofectamine, the telomerase activity in HeLa cells expressing teloRZ decreased to one eighth of that in the control cells. The doubling time increased significantly and the apoptosis ratio was elevated with increasing population doublings (PDS). After 19-20 PDS 95% cells were apoptotic. To further investigate the effect of teloRZ on tumor growth, the eukaryotic expression plasmid containing teloRZ was injected into transplanted tumor of nude mouse. The teloRZ e     

Inhibition of telomerase in tumor cells by ribozyme targeting telomerase RNA component

Telomerase plays an important role in cell proliferation and carcinogenesis and is believed to be a good target for anti-cancer drugs. Elimination of template function of telomerase RNA may repress the telomerase activity. A hammer-headed ribozyme (telomerase ribozyme, teloRZ) directed against the RNA component of human telomerase (hTR) was designed and synthesized. TeloRZ showed a specific cleavage activity against the hTR. The cleavage efficacy reached 60%. A eukaryotic expression plasmid containing teloRZ gene was inducted into HeLa cells by lipofectamine, the telomerase activity in HeLa cells expressing teloRZ decreased to one eighth of that in the control cells. The doubling time increased significantly and the apoptosis ratio was elevated with increasing population doublings (PDS). After 19–20 PDS 95% cells were apoptotic. To further investigate the effect of teloRZ on tumor growth, the eukaryotic expression plasmid containing teloRZ was injected into transplanted tumor of nude mouse. The teloRZ effectively inhibited the telomerase activity in transplanted tumor, promoted apoptosis of the transplanted tumor cells, and decreased the tumor size significantly. These results indicate that teloRZ can effectively inhibit telomerase activity and growth of tumor cells, and suggest the potential use of this ribozyme in anti-cancer therapy.     

以hTR模板区为靶点的抗肿瘤药物设计策略

端粒酶几乎在所有的人类癌细胞中均异常表达,它的持久活性对肿瘤的增殖是必需的。因此,抑制端粒酶活性代表了一种新的癌症治疗机制。端粒酶全酶复合物有多处可以做为抑制剂的靶点,包括hTR、hTERT、引物锚定位点等。本文对以端粒酶RNA模板区为靶点的抗肿瘤药物设计策略进行了综述,包括对该区域进行点突变、使用反义寡核苷酸封闭模板区、改变端粒酶RNA空间构象等,并探讨了目前抑制端粒酶活性研究中存在的一些问题。     

siRNA降低肿瘤细胞端粒酶活性的研究

利用T7RNA聚合酶在体外转录合成针对端粒酶模板RNA(hTR)的两条互补单链RNA,经退火形成siRNA.采用TRAP法检测端粒酶活性,分析siRNA在肿瘤细胞裂解液的干扰作用.结果表明:T7RNA聚合酶可以高效地转录出短的单链RNA,制备的siRNA可明显地降低肿瘤端粒酶的活性,其降低肿瘤端粒酶活性的作用强于等量的反义链RNA.该法廉价、高效、简易,有可能为肿瘤的基因治疗提供一种新的探索途径.