中华蜜蜂DNA甲基化转移酶Dnmt3基因克隆及表达谱分析

为探究中华蜜蜂Apis cerana cerana的DNA甲基化模式, 本研究采用RT PCR技术克隆了中华蜜蜂DNA甲基化转移酶3（Dnmt3）基因(GenBank登录号为JQ740768); 采用荧光定量PCR检测不同发育时期工蜂（4日龄蛹, 1, 7和30日龄成年蜂及产卵工蜂）和蜂王（4日龄蛹, 1日龄蜂王和产卵蜂王）头部的Dnmt3基因mRNA的表达量。结果表明： 该基因cDNA序列全长2 277 bp, 编码758个氨基酸残基, 预测的蛋白分子量为88.24 kD, 等电点为7.85。将中华蜜蜂与其他物种的Dnmt3基因的结构域进行比对, 同时将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的Dnmt3氨基酸序列进行同源性比对和系统发育分析, 发现与西方蜜蜂的Dnmt3序列一致性高达99%。该基因在工蜂和蜂王不同发育时期均有表达, 1日龄工蜂与7日龄工蜂中没有显著差异(P>0.05), 30日龄工蜂中的表达量显著高于前两者 (P<0.05); 蜂王蛹中的表达量显著高于工蜂蛹 (P<0.05); 1日龄的蜂王中的表达量显著高于1日龄的工蜂(P<0.05); 产卵工蜂与产卵蜂王中的表达量没有差异（P>0.05）。这种表达情况提示其可能与工蜂劳动分工及蜜蜂卵巢发育有关。     

Cloning and expression profiling of the DNA methyltransferase Dnmt3 gene in the Chinese honeybee, Apis cerana cerana (Hymenoptera:Apidae )

为探究中华蜜蜂Apis cerana cerana的DNA甲基化模式,本研究采用RT-PCR技术克隆了中华蜜蜂DNA甲基化转移酶3( Dnmt3)基因(GenBank登录号为JQ740768);采用荧光定量PCR检测不同发育时期工蜂(4日龄蛹,1,7和30日龄成年蜂及产卵工蜂)和蜂王(4日龄蛹,1日龄蜂王和产卵蜂王)头部的Dnmt3基因mRNA的表达量.结果表明:该基因cDNA序列全长2 277 bp,编码758个氨基酸残基,预测的蛋白分子量为88.24 kD,等电点为7.85.将中华蜜蜂与其他物种的Dnmt3基因的结构域进行比对,同时将该基因推导的氨基酸序列与其他物种的Dnmt3氨基酸序列进行同源性比对和系统发育分析,发现与西方蜜蜂的Dnmt3序列一致性高达99％.该基因在工蜂和蜂王不同发育时期均有表达,1日龄工蜂与7日龄工蜂中没有显著差异(P＞0.05),30日龄工蜂中的表达量显著高于前两者(P＜0.05);蜂王蛹中的表达量显著高于工蜂蛹(P＜0.05);1日龄的蜂王中的表达量显著高于1日龄的工蜂(P＜0.05);产卵工蜂与产卵蜂王中的表达量没有差异(P＞0.05).这种表达情况提示其可能与工蜂劳动分工及蜜蜂卵巢发育有关.     

中华蜜蜂dynactin p62基因的克隆及不同发育阶段表达分析

为探究中华蜜蜂Apis cerana cerana dynactin p62基因的表达特性, 本研究克隆了中华蜜蜂dynactin p62的基因组DNA序列(GenBank登录号： JX101463) 和mRNA序列（GenBank登录号： JX101464）; 采用荧光定量PCR检测了中华蜜蜂dynactin p62在不同发育时期（3日龄和6日龄幼虫、 刚羽化出房蜜蜂）三型蜂中mRNA的表达量。结果表明： 该基因基因组DNA序列全长为2 403 bp, mRNA序列全长为1 491 bp, 编码496个氨基酸残基, 预测的蛋白分子量为56.49 kD, 等电点为8.31。系统发育分析表明中华蜜蜂dynactin p62与西方蜜蜂Apis mellifera dynactin p62聚成一支。该基因在不同发育时期均有表达, 在雌性蜜蜂（蜂王和工蜂）中, 刚羽化成虫期的表达量显著高于幼虫期(P<0.05), 并且同一发育时期相比, 工蜂的表达量显著高于蜂王(P<0.05); 而该基因在雄蜂中表达量没有明显的规律性。这些结果提示该基因可能与中华蜜蜂级型分化有关。     

发育温度对蜜蜂归巢能力及记忆相关基因表达的影响

【目的】本试验旨在研究不同发育温度对意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica工蜂归巢能力及学习记忆相关基因表达的影响。【方法】选择3群群势一致的意大利蜜蜂,控制蜂王在一张经工蜂清理的工蜂巢脾中产卵48 h,之后移至孵化区。子脾即将封盖时,平均分成3块,分别放入33℃(Ⅰ组)、35℃(Ⅱ组)、37℃(Ⅲ组)的恒温恒湿箱中继续发育(相对湿度为75%±5%),每群为1个重复。工蜂羽化出房时,用不同颜色标记不同发育温度下羽化的工蜂,并放回原蜂王产卵群,测定其采集时期在1 000 m、2 000 m的回归率及不同日龄(刚出房,10日龄,20日龄)工蜂3个记忆相关基因[谷氨酸受体A型基因(Glu-RA)、N-甲基-D-天冬氨酸受体1型基因(Nmdar1)、酪氨酸受体1型基因(tyr1)]的表达情况。【结果】结果表明:试验Ⅱ组和试验Ⅲ组发育的采集蜂在1 000 m和2 000 m处的回归率均显著高于Ⅰ组,但试验Ⅱ组与试验Ⅲ组之间差异不显著;试验Ⅱ组和Ⅲ组刚出房工蜂、10日龄工蜂和20日龄工蜂的Glu RA和Nmdar1基因相对表达量显著高于试验Ⅰ组,但试验Ⅱ组与Ⅲ组之间差异不显著;试验Ⅱ组刚出房工蜂的Tyr1基因相对表达量显著高于试验Ⅰ组与Ⅲ组,但试验Ⅰ组与试验Ⅲ组之间差异不显著,另外,各试验组10日龄和20日龄工蜂Tyr1基因相对表达量差异均不显著。【结论】过低发育温度会影响蜜蜂的归巢能力和记忆相关基因的表达。     

西方蜜蜂磁受体基因AmMagR的克隆及表达分析

本研究旨在克隆西方蜜蜂Apis mellifera磁受体基因AmMagR的序列,并分析该基因在工蜂不同日龄、不同组织中的表达特征,以期为该基因的功能研究提供理论基础。以西方蜜蜂工蜂为材料,提取其总RNA,通过RT-PCR技术克隆西方蜜蜂MagR基因的序列;利用多种生物信息学软件对其核酸及氨基酸序列分析;采用实时荧光定量PCR技术(qPCR)分析在西方蜜蜂工蜂不同日龄(1日龄、5日龄和21日龄)和不同组织(头部、胸部和腹部)中MagR基因的相对表达量。克隆到西方蜜蜂MagR基因,并命名为AmMagR(GenBank登录号:MH635411),其序列长度为748 bp,编码区长390 bp,编码130个氨基酸,其蛋白质分子量为14.142 kDa,理论等电点为9.06,无信号肽,无跨膜结构,且在第24～126位氨基酸之间得到一个结构域Fe-S_biosyn。系统发育树显示,西方蜜蜂AmMagR与小蜜蜂Apis florae AfIscA(IscA别称MagR)、中华蜜蜂Apis cerana cerana AcIscA基因聚成一支。荧光定量PCR结果表明,AmMagR基因在西方蜜蜂不同日龄的工蜂头部、胸部和腹部均有表达。5日龄工蜂的相对表达量最高,5日龄工蜂头部和胸部的AmMagR基因表达量显著高于1日龄(P0.05)和21日龄(P0.05),腹部AmMagR基因表达量显著高于21日龄(P0.05),但与1日龄的比较差异不显著(P0.05)。1日龄、5日龄和21日龄工蜂胸部的AmMagR基因表达量均显著高于头部和腹部(P0.05);1日龄工蜂头部AmMagR基因表达量均高于腹部(P0.05),但5日龄和21日龄工蜂AmMagR基因在头部与腹部的表达量无显著差异(P0.05)。明确了该基因在西方蜜蜂工蜂不同日龄和不同组织中的表达模式,并推测AmMagR可能参与了西方蜜蜂的定位、归巢过程。     

中华蜜蜂mrjp1 cDNA的克隆及其序列分析

构建中华蜜蜂(Apis cerana cerana)8日龄工蜂头部cDNA文库,利用中蜂基因组的mrjp3部分基因片段作为杂交探针,采用DIG标记筛选cDNA文库,获得mrjps阳性克隆120个;对阳性克隆进行PCR扩增和测序,通过NCBI的BLAST序列比对,获得12个与印度蜂(Apis cerana india)、西方蜜蜂(Apis mellifera L.)mrjp1基因同源的中蜂mtjp1 cDNA片段,并进一步对中华蜜蜂mrjp1的cDNA全序列进行测定和分析。序列比对分析表明,东方蜜蜂(Apis cerana)与西方蜜蜂mrjp1的cDNA序列相似性为93．78％,中华蜜蜂与印度蜂的相似性高达99．36％,这一结果从分子水平证实中华蜜蜂与印度蜂有较近的共同祖先,而东方蜜蜂与西方蜜蜂的亲缘关系较远。     

中华蜜蜂mab-21基因序列分析及表达特征

【目的】探究中华蜜蜂 Apis cerana cerana Male abnomal 21（mab-21）基因在不同发育阶段的表达特性及染螨条件下mab-21基因表达变化规律。【方法】本研究利用RT-PCR方法,克隆了中华蜜蜂mab-21的基因编码区;采用荧光定量PCR方法检测了中华蜜蜂mab-21在不同发育时期（新出房蜂、哺育蜂、守卫蜂及采集蜂）工蜂头部中mRNA的表达量以及接种大蜂螨 Varroa destructor 前后mab-21基因的表达变化。【结果】克隆获得中华蜜蜂mab-21 cDNA,命名为 Accmab 21（GenBank登录号KR000001）。序列分析显示, 该编码区开放阅读框长为1 098 bp,编码365个氨基酸,推测的编码蛋白的相对分子量和等电点分别为41.63 kD和8.53。系统发育分析表明中华蜜蜂mab-21与西方蜜蜂 Apis mellifera mab-21、小蜜蜂Apis florea mab-21和熊蜂Bombus impatiens mab-21聚成一支。该基因在中华蜜蜂工蜂的不同发育时期均有表达,其中哺育蜂阶段显著高于新出房蜂、守卫蜂和采集蜂(P<0.05)。接种大蜂螨后,哺育蜂和守卫蜂中mab-21基因的表达下降显著(P<0.05);而在新出房蜂和采集蜂中表达量变化不显著。【结论】该基因可能与中华蜜蜂抗螨行为相关。     

意大利蜜蜂职能相关的两个细胞色素P450基因在附肢中的表达分析

[目的]本研究分析意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica中细胞色素P450基因CYP6BD1和CYP49A1在不同日龄工蜂及相同日龄不同职能工蜂的附肢中的表达模式,旨在更好了解细胞色素P450基因在不同职能工蜂处理外源物质过程中的作用.[方法]通过组建蜂群收取3日龄工蜂、10日龄哺育蜂、21日龄采集蜂和21日龄哺育蜂样本,利用荧光定量PCR技术分别检测细胞色素P450基因CYP6BD1和CYP49A1在附肢(触角、前足、中足、后足)中表达情况.[结果]基因CYP6BD1在3日龄工蜂、10日龄哺育蜂、21日龄采集蜂各附肢中的表达量均依次显著增加,且该基因在21日采集蜂各附肢中的表达量显著高于21日哺育蜂;与CYP6BD1基因相比,基因CYP49A1在不同职能工蜂附肢中的表达量均较低,但在3日龄工蜂各附肢中表达相对较高.[结论]基因CYP6BD1和CYP49A1分别在采集蜂和3日龄工蜂各附肢中高量表达,2个基因在降解蜂群外和蜂群内部外源性物质中发挥重要作用,为进一步研究膜翅目昆虫的职能分工提供新的视角.     

西方蜜蜂采集蜂上颚腺中高表达基因的筛选与表达分析

【目的】本研究旨在筛选西方蜜蜂Apis mellifera采集蜂上颚腺中高表达基因,为进一步筛选和研究蜜蜂采集行为相关基因提供依据。【方法】基于前期测序的西方蜜蜂5种不同职能工蜂(3日龄工蜂、10日龄哺育蜂、10日龄采集蜂、21日龄哺育蜂和21日龄采集蜂)上颚腺转录组数据,筛选采集蜂上颚腺的差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),并对这些DEGs进行GO和KEGG分析;qRT-PCR检测随机选取的8个DEGs在10日龄哺育蜂和10日龄采集蜂上颚腺以及两个关键DEGs(Δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因Amp5cs和细胞色素P450 9e2基因CYP9Q3)在工蜂不同发育时期和采集蜂各组织中的表达量。【结果】筛选到22个DEGs在21日龄采集蜂上颚腺中的表达量显著高于在3日龄工蜂、10日龄哺育蜂和21日龄哺育蜂上颚腺中的表达量,同时在10日龄采集蜂上颚腺中的表达量也显著高于在10日龄哺育蜂上颚腺中的表达量。GO和KEGG富集分析显示这些DEGs主要富集在胆固醇代谢、半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、细胞凋亡-果蝇、氨基酸生物合成等方面。qRT-PCR结果表明,8个DEGs(LOC100576395, LOC411983, LOC410235, LOC725581, LOC410527, LOC406131, LOC408453和LOC410253)的表达模式与转录组数据的表达模式一致;2个关键DEGs Amp5cs和CYP9Q3在工蜂各发育阶段均有表达,且在采集蜂中表达量最高;Amp5cs在采集蜂腹、胸、上颚腺和触角中高量表达,P450 9e2在采集蜂触角 和足中表达量显著高于在其他组织中的。【结论】本研究在减小日龄因素干扰下筛选了西方蜜蜂采集蜂上颚腺中22个高表达的DEGs,这些DEGs可能主要参与采集蜂上颚腺生理发育以及能量供应、外源性物质解毒、花蜜转化等代谢通路,进而影响蜜蜂的采集行为。这些结果为西方蜜蜂上颚腺的功能研究提供理论参考,同时也为采集力强的新品种培育奠定了基础。     

不同水平亮氨酸对繁殖期意大利蜜蜂蜂群群势及工蜂发育的影响

【目的】评价日粮中不同水平亮氨酸对繁殖期意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica蜂群群势及工蜂发育的影响。【方法】选取重庆荣昌本地繁殖期意大利蜜蜂21群,随机分为7组,分别饲喂添加0,15.30,17.50,26.25,35.00,43.75和52.5 g/kg亮氨酸的试验日粮,每12 d测定各组蜂群群势、封盖子量、蜂群取食量和营造王台情况,24 d后测定蜂群采集行为、工蜂初生重、工蜂虫体蛋白质含量及工蜂寿命。【结果】当亮氨酸添加水平为43.75和52.50 g/kg时能够显著提高繁殖期意大利蜜蜂的蜂群群势、封盖子量、蜂群取食量及采集行为(P0.05)。与空白对照组相比,基础日粮组及各亮氨酸添加组的新出房蜂和6日龄幼虫体蛋白质含量较高(P0.05);各亮氨酸添加组的工蜂初生重显著高于空白组(P0.05);不同亮氨酸添加水平对意大利蜜蜂工蜂寿命影响较小。此外,亮氨酸添加水平26.25,35.00和43.75 g/kg能够在饲喂0-24 d时促进蜂群营造自然王台,刺激蜂群分蜂。【结论】配方日粮中43.75和52.5 g/kg的亮氨酸能够显著促进繁殖期意大利蜜蜂蜂群发展,其中43.75 g/kg的亮氨酸饲喂量还能刺激蜂群营造自然王台,激发蜂群分蜂。     

西方蜜蜂Lozenge基因的克隆鉴定及时空表达分析

Lozenge蛋白（Lz蛋白）是昆虫的重要转录因子,在昆虫胚胎发育过程中发挥重要作用。为研究Lozenge在西方蜜蜂Apis mellifera中的作用,本研究克隆了Lozenge基因,并对其进行生物信息学分析,同时基于荧光定量PCR技术检测该基因在西方蜜蜂不同发育时期（卵期、幼虫期、蛹期和成年蜂）和10日龄哺育蜂各组织的表达谱。生物信息学分析结果显示,Lozenge基因的开放阅读框（ORF）为1 554 bp,共编码517个氨基酸,预测分子量为54.63918 kDa,等电点为6.08;结构域预测分析发现Lozenge蛋白含有一个Runt结构域,多物种蛋白序列对比发现该蛋白同源性高。时期表达谱表明,该基因在第1日卵和第2日卵的表达量远高于其他时期,在卵期表达量随时间依次递减,幼虫期表达量极低,蛹期表达量呈先增后减的趋势,而成年蜂中均有表达;组织表达谱显示,该基因在哺育蜂头部、上颚腺中的表达量较高,而在腹部的表达量低。这些结果表明,Lozenge基因可能在西方蜜蜂胚胎期细胞发育过程、哺育蜂蜂王浆合成和分泌过程中发挥重要作用,这些结果为该基因功能的深入研究提供了重要的理论参考。     

西方蜜蜂不同级型王浆主蛋白MRJP8基因的表达差异

王浆主蛋白在蜜蜂的级型分化中具有重要的功能。为探究mrjp8在西方蜜蜂Apis mellifera不同级型的表达模式及功能差异。【方法】 利用荧光定量PCR技术对西方蜜蜂工蜂、 雄蜂和蜂王不同发育时期和不同组织的mrjp8表达水平进行检测。【结果】 工蜂体内mrjp8在9日龄前后的毒腺组织内特异性高表达, 为参照基因表达量的上万倍, 在其他发育时期和组织的表达量则明显较低, 其表达具有明显的时空特异性; 在雄蜂体内其表达量与对照相当; 在蜂王体内表达量可达参照的近1 000倍, 没有组织特异性。【结论】 mrjp8的这种表达模式提示其在工蜂防御及维系蜂王长寿命方面有积极作用, 这为进一步研究该基因乃至整个王浆蛋白基因家族的进化和功能分化提供了依据。     

RNAi沉默王浆主蛋白1(Mrjp1)基因对意大利蜜蜂工蜂学习和记忆的影响

【目的】前期研究发现经吡虫啉处理的意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica(简称“意蜂”)工蜂学习能力下降,转录组学分析表明王浆主蛋白1(major royal jelly protein 1, MRJP1)基因在吡虫啉处理的蜜蜂脑中显著下调,MRJP1可能参与调控蜜蜂学习能力。本研究旨在采用RNA干扰(RNAinference, RNAi)技术将Mrjp1特异性沉默,验证MRJP1在意蜂工蜂嗅觉学习中的关键作用。【方法】通过克隆技术获得Mrjp1基因cDNA 序列,经测序验证后,设计引物,合成用于RNAi干扰Mrjp1基因表达的dsRNA。注射dsMrjp1的意蜂工蜂作为处理组(dsMrjp1注射组),注射dsEGFP的意蜂工蜂作为对照组(dsEGFP注射组),随后通过伸吻反应(proboscis extension response, PER)实验比较两组的嗅觉学习与记忆能力差异。最后采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测注射dsMrjp1后意大利蜜蜂工蜂脑中Mrjp1的相对表达量。【结果】dsMrjp1注射组与dsEGFP注射组意蜂工蜂学习能力差异显著,dsMrjp1注射组意蜂工蜂的学习能力显著降低。学习后2 h,两组意蜂工蜂的记忆力无显著差异。qRT-PCR结果显示Mrjp1的表达水平在dsMrjp1注射组意蜂工蜂脑中显著低于dsEGFP注射组,表明学习能力降低的处理组意蜂脑内对应的Mrjp1表达水平也降低。【结论】通过RNAi抑制意蜂工蜂Mrjp1基因的表达后,其嗅觉学习能力受到显著性抑制,但记忆力未受到显著影响,提示Mrjp1可能是调控意蜂学习的重要基因之一。本研究结果有助于后续进一步研究蜜蜂嗅觉学习相关的分子机制。     

蜜蜂TPI基因克隆与生物信息学预测

利用电子克隆方法获得蜜蜂(Apis mellifera)磷酸甘油醛异构酶(triosephosphate isomerase,TPI)基因,并采用生物信息学方法对该基因编码蛋白从等电点、疏水性/亲水性、二级结构等进行了预测,以及试验验证,结果表明蜜蜂TPI基因全长为1 768 bp,具有完整的开放阅读框架(ORF),并得到了试验证实.