下一代测序技术在表观遗传学研究中的重要应用及进展

下一代测序技术(Next generation sequencing,NGS)的出现,极大地促进了表观遗传学的研究。将NGS技术引入表观遗传学,便形成了以NGS为基础的各种表观遗传学测序及研究方法,如:全基因组亚硫酸氢盐测序法(Whole genome bisulfite sequencing,WGBS)、简化代表性亚硫酸氢盐测序法(Reduced representation bisulfite sequencing,RRBS)、甲基化DNA免疫共沉淀测序(Methylated DNA immunoprecipitationsequencing,MeDIP-seq)、染色质免疫共沉淀测序(Chromatin immunoprecipitation-sequencing,ChIP-seq)、Tet辅助重亚硫酸盐测序法(Tet-assisted bisulfite sequencing,TAB-seq)、各种染色体构象捕获测序(Chromosome conformation capture sequencing,3C-seq)技术、DnaseⅠ-seq/MNase-seq/FAIRE-seq以及RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)。这些方法的应用和普及改变了人们对多种表观遗传现象的传统认识,使研究人员能够更加全面地深入了解各种表观遗传标志在机体内的广泛分布,以及如何在外界因素的影响下发生相应的动态变化。文章概述了当今主要商业NGS平台的原理和特点,系统介绍了以NGS方法为基础衍生出来的各种表观遗传学测序及研究方法,并在此基础上对近年来应用NGS技术在表观遗传学研究领域中取得的最新研究成果进行了综述。     

染色质免疫沉淀-测序：全基因组范围研究蛋白质-DNA相互作用的新技术

染色质免疫沉淀-测序(ChIP-seq)是近年来新兴的将染色质免疫沉淀(ChIP)与深度测序技术相结合,在全基因组范围内分析DNA结合蛋白结合位点、组蛋白修饰、核小体定位和DNA甲基化的高通量技术．在新一代测序(NGS)技术的大力推动下,ChIP-seq提供了一种相对于ChIP-chip高分辨率、低噪音、高覆盖率的研究方法．随着测序成本的降低,ChIP-seq逐步成为研究基因调控和表观遗传机制的一种常用手段．本文就该技术的最近研究进展进行综述,并着重介绍ChIP-seq数据分析过程及该技术的实际应用情况.     

核小体定位的转录调控功能研究进展

核小体是真核生物染色质的基本组成单位,组蛋白八聚体在DNA 双螺旋上精确位置称为核小体定位．核小体定位已被证实在基因转录调控、DNA复制与修复、调控进化等过程中扮演着重要的角色．随着染色质免疫共沉淀-芯片(ChIP-chip)与染色质免疫共沉淀-测序(ChIP-seq)等高通量技术的出现,已测定了多种模式生物全基因组核小体定位图谱,掀起了一股核小体定位及其功能的研究热潮,并取得了一定的成果．本文介绍了核小体定位的概念,总结了核小体在启动子与编码区域内定位的基本模式．在此基础上,综述了核小体定位在转录起始、转录延伸、基因表达模式多样化以及可变剪接等方面的功能研究进展．     

三维基因组染色质构象捕获及其衍生技术

线性染色质经过多重折叠凝缩到真核生物的细胞核中,染色质的三维构象直接决定了真核生物的基因表达,因此染色质可以在局部或远程空间上发生互作调控基因转录。折叠成环状构象的染色质可以借助染色质构象捕获 (Chromosome conformation capture,3C) 技术来研究,基于3C技术扩展的4C/5C/Hi-C从单个位点延伸到全基因组捕捉三维构象,在此基础上,染色质构象核心技术可以与免疫共沉淀、核酸分子杂交、单细胞、基因组测序等技术偶联而产生新的衍生技术和应用,这极大地推动了染色质构象技术在基因时空特异性表达调控上的研究。文中将以3C和Hi-C等三维基因组核心技术为基础,重点介绍染色质构象捕获及其衍生技术的原理和前沿应用。     

植物着丝粒结构及进化的研究进展

植物着丝粒是染色体重要结构域,介导动粒装配。不同物种间着丝粒重复序列快速趋异进化,着丝粒功能保守,确保有丝分裂和减数分裂过程中染色体正确分离和准确传递。伴随染色质免疫共沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)、ChIP 与高密度芯片相结合技术(ChIP-chip)、ChIP 与高通量测序相结合技术(ChIP-seq)的应用,植物着丝粒研究获得里程碑式进展:某些模式植物着丝粒DNA 序列、蛋白质结构、功能获得大量新认识;着丝粒基本蛋白质组蛋白H3 被用来界定着丝粒大小和边界;某些非着丝粒区域被激活为新着丝粒,在世代传递中保持稳定性。本文对植物着丝粒结构、功能、进化研究进行了综述,并探讨了植物着丝粒研究存在的问题。     

染色质免疫共沉淀实验方法

染色质免疫共沉淀(ChIP)技术是一种检测蛋白质与DNA结合的实验技术。该方法可以先进行样品交联, 然后将蛋白质与DNA复合物进行随机DNA切断, 再借助免疫学方法特异性富集与目的蛋白相结合的DNA片段, 从而检测转录因子等目的蛋白质与DNA的结合情况, 鉴定基因启动子或其它DNA结合位点。该方法同时也可应用于研究基因组特定位点的组蛋白修饰情况。该文介绍了依赖交联固定的常规免疫共沉淀(X-ChIP), 以及适用于10³细胞级别微量实验材料的基于微球菌核酸酶非交联免疫共沉淀(ULI-NChIP)具体操作过程和注意事项。     

染色质免疫共沉淀实验方法

染色质免疫共沉淀(ChIP)技术是一种检测蛋白质与DNA结合的实验技术。该方法可以先进行样品交联,然后将蛋白质与DNA复合物进行随机DNA切断,再借助免疫学方法特异性富集与目的蛋白相结合的DNA片段,从而检测转录因子等目的蛋白质与DNA的结合情况,鉴定基因启动子或其它DNA结合位点。该方法同时也可应用于研究基因组特定位点的组蛋白修饰情况。该文介绍了依赖交联固定的常规免疫共沉淀(X-ChIP),以及适用于10~3细胞级别微量实验材料的基于微球菌核酸酶非交联免疫共沉淀(ULI-NChIP)具体操作过程和注意事项。     

一种微小染色质免疫共沉淀方法的建立

染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是目前研究蛋白与DNA相互作用的强有力的技术之一.然而传统的ChIP实验方法的最大缺陷是要求大量的细胞数,这限制了它应用于少量细胞数的样品.在传统ChIP实验的基础上综合国外文献建立了一种能在少量细胞样品中进行的染色质免疫共沉淀实验,称之为微小染色质免疫共沉淀(miniChIP).并通过对诱导前后的MEL细胞中表达的β珠蛋白基因簇组蛋白H4乙酰化(acH4)的研究,证实了其可靠性和特异性.结果显示:高敏位点HS2和活跃基因β-maj的启动子区域存在一定的组蛋白H4乙酰化水平,DMSO诱导后显著增加,而不活跃基因Ey的启动子区域则检测到极低水平的组蛋白H4乙酰化,且诱导后无明显变化.     

下一代测序技术在干细胞转录调控研究中的应用

基因转录调控及其机制分析是后基因组时代生物学研究的重点之一。随着高通量测序技术的发展,人们可以从不同层面研究基因的转录调控行为,从转录组、转录因子结合,到染色质局部结构和整体空间构象,可系统分析转录调控的分子机制。干细胞分化过程的转录调控分析对研究再生医学和理解细胞癌变机制等具有重要意义。本文综述了下一代测序技术在干细胞转录调控研究中的应用,包括：(1)基于基因芯片或RNA测序的转录组分析;(2)基于染色体免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)测序的表观基因组和转录因子结合信息的分析;(3)基于DNase 酶切测序(DNase-Seq)的染色质开放性分析;(4)基于高通量染色质构象捕获(high-throughput chromosome conformation capture, Hi-C)技术的染色体远程相互作用分析。从基因表达谱、转录因子结合和基因组三维结构等层面展开介绍,重点关注了一些多能性转录因子(Oct4、Sox2和Nanog等)在维持干细胞干性和分化中的调控作用,以期为干细胞转录调控的研究提供借鉴和参考。     

染色质互作相关转录因子的挖掘及功能分析

染色质互作是真核生物基因组组装的基础,并且在调控真核基因细胞特异性表达中发挥重要作用.染色质互作的发生与特定的蛋白质有关,目前已经发现CTCF (CCCTC binding facor,转录阻抑物)和黏连蛋白与染色质互作相关,然而并不清楚是否还有其他蛋白质参与染色质互作.我们将整合高通量染色体构象捕获(Hi-C)和染色质免疫沉淀-测序(ChIP-seq)数据,在GM12878和K562细胞系中挖掘与染色质互作相关的转录因子,并对发现的转录因子做功能分析.我们在频繁发生互作的染色质位点中发现RUNX3、SPI1等转录因子也可能参与染色质互作.另外,通过FP-growth的数据挖掘方法还发现多个转录因子可能协同作用参与染色质互作.研究结果将为染色质互作相关实验的开展提供先验知识.     

Universal Count Correction for High-Throughput Sequencing

We show that existing RNA-seq, DNase-seq, and ChIP-seq data exhibit overdispersed per-base read count distributions that are not matched to existing computational method assumptions. To compensate for this overdispersion we introduce a nonparametric and universal method for processing per-base sequencing read count data called Fixseq. We demonstrate that Fixseq substantially improves the performance of existing RNA-seq, DNase-seq, and ChIP-seq analysis tools when compared with existing alternatives.     

LOcating Non-Unique matched Tags (LONUT) to Improve the Detection of the Enriched Regions for ChIP-seq Data

One big limitation of computational tools for analyzing ChIP-seq data is that most of them ignore non-unique tags (NUTs) that match the human genome even though NUTs comprise up to 60% of all raw tags in ChIP-seq data. Effectively utilizing these NUTs would increase the sequencing depth and allow a more accurate detection of enriched binding sites, which in turn could lead to more precise and significant biological interpretations. In this study, we have developed a computational tool, LOcating Non-Unique matched Tags (LONUT), to improve the detection of enriched regions from ChIP-seq data. Our LONUT algorithm applies a linear and polynomial regression model to establish an empirical score (ES) formula by considering two influential factors, the distance of NUTs to peaks identified using uniquely matched tags (UMTs) and the enrichment score for those peaks resulting in each NUT being assigned to a unique location on the reference genome. The newly located tags from the set of NUTs are combined with the original UMTs to produce a final set of combined matched tags (CMTs). LONUT was tested on many different datasets representing three different characteristics of biological data types. The detected sites were validated using de novo motif discovery and ChIP-PCR. We demonstrate the specificity and accuracy of LONUT and show that our program not only improves the detection of binding sites for ChIP-seq, but also identifies additional binding sites.     

Arpeggio: harmonic compression of ChIP-seq data reveals protein-chromatin interaction signatures

Researchers generating new genome-wide data in an exploratory sequencing study can gain biological insights by comparing their data with well-annotated data sets possessing similar genomic patterns. Data compression techniques are needed for efficient comparisons of a new genomic experiment with large repositories of publicly available profiles. Furthermore, data representations that allow comparisons of genomic signals from different platforms and across species enhance our ability to leverage these large repositories. Here, we present a signal processing approach that characterizes protein–chromatin interaction patterns at length scales of several kilobases. This allows us to efficiently compare numerous chromatin-immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) data sets consisting of many types of DNA-binding proteins collected from a variety of cells, conditions and organisms. Importantly, these interaction patterns broadly reflect the biological properties of the binding events. To generate these profiles, termed Arpeggio profiles, we applied harmonic deconvolution techniques to the autocorrelation profiles of the ChIP-seq signals. We used 806 publicly available ChIP-seq experiments and showed that Arpeggio profiles with similar spectral densities shared biological properties. Arpeggio profiles of ChIP-seq data sets revealed characteristics that are not easily detected by standard peak finders. They also allowed us to relate sequencing data sets from different genomes, experimental platforms and protocols. Arpeggio is freely available at http://sourceforge.net/p/arpeggio/wiki/Home/.