原生质体再生对糙皮侧耳Pleurotus ostreatus病毒脱除的效果

以糙皮侧耳Pleurotus ostreatus菌株新831和豫6为材料,从这两个菌株的菌丝体中提取了糙皮侧耳病毒基因组,共有3个dsRNA片段,大小分别为8.2kb、2.6kb和1.1kb。采用菌丝尖端分离脱毒、原基组织分离脱毒和原生质体再生脱毒技术对糙皮侧耳菌丝体进行脱毒处理,利用dsRNA技术对脱毒效果进行检测。结果显示,原基组织分离脱毒后3个条带依然存在;菌丝尖端分离脱毒后,8.2kb和1.1kb 2个条带完全脱除,2.6kb的条带亮度有所减弱;原生质体再生脱毒后3个条带完全脱除;对3种脱毒技术得到的菌株进行生理生化指标测定,结果显示,原生质体再生脱毒菌株的菌丝生长速度、生物量、呼吸强度、纤维素酶活等均明显优于出发菌株、原基组织分离脱毒和菌丝尖端分离脱毒菌株;栽培结果表明,原生质体再生脱毒菌株前两茬菇的生物学效率达到96.4%－99.1%,比出发菌株提高19.9%－25.4%,并且菌盖宽度和长度有所增加,表明原生质体再生技术可以有效脱除糙皮侧耳菌株病毒,提高糙皮侧耳栽培产量。     

食用菌病毒脱毒方法的比较

应用dsRNA技术从平菇天达300(Pleurotus ostreatus TD300)菌丝中提取到4条dsRNA条带,大小分别是8.2、2.5、2.1和1.1kb。采用菌丝尖端脱毒法、原生质体再生法、冷冻真空干燥法和单孢杂交法进行脱毒,各得到一株脱毒菌株,分别是HTC8、PR15、FL01和SSH11。脱毒菌株HTC8仅残留有低含量的8.2kbdsRNA,PR15和SSH11完全脱去dsRNA,而FL01仍残留有低浓度的8.2kb和2.5kbdsRNA。该4株脱毒菌株的菌丝生长速度和漆酶活力均比出发菌种有不同程度的提高,尤其是HTC8和PR15,菌丝生长速度比出发菌种分别提高22.73%和18.18%,漆酶活力比出发菌种分别提高145.83%和134.38%。综合比较此4种脱毒方法,菌丝尖端脱毒法和原生质体再生脱毒法比冷冻真空干燥法和单孢杂交法脱毒效果好,制备脱毒菌株用时短、效率高。     

茶树菇原生质体再生及单核体菌株的特性

【背景】茶树菇遗传育种工作是茶树菇产业持续发展的保障和关键,原生质体的制备及单核体菌株的获得可为茶树菇遗传育种工作的开展提供技术支持。【目的】获得茶树菇原生质体的再生特性、单核化特性及其交配型,为开展茶树菇的杂交育种、融合育种、诱变育种、遗传转化和功能基因挖掘等奠定基础。【方法】以茶树菇保藏菌种Aa11的菌丝为材料,采用甘露醇溶液和溶壁酶溶液直接处理平板菌丝制备茶树菇原生质体,而后对原生质体进行分离和再生培养。通过原生质体单核菌丝体两两单单对峙培养,观察对峙培养过程中的菌落形态变化。【结果】当接种块数量为7、酶解温度为33-34℃、酶解时间为60-80 min时,原生质体数量为107个/mL。茶树菇原生质体在涂布平板7 d后肉眼才可见明显的再生菌落形成,在再生培养基上再生率为0.71%,单核化率为41.1%;再生异核体和再生单核体在形成再生菌落时有时间差,从第7天开始往后连续3 d的再生菌落均为异核体菌株,往后第4天开始陆续出现单核体菌落,之后时间内的菌落均为单核体菌株。试验共得到290个原生质体单核体,分为A1B1和A2B2两种亲本交配型,A1B1和A2B2二者的比例为138:152...     

毛栓菌原生质体制备和再生及单核菌株产漆酶特性

毛栓菌Trametes hirsuta能有效地降解木质素,在生物燃料、制浆和饲料工业等方面具有很高应用价值。为了获得遗传性能稳定的T. hirsuta单核菌株,研究了其菌丝生长培养基的类型、菌丝生长时间（菌龄）、酶解时间、原生质体纯化离心速度和原生质体再生培养基类型对T. hirsuta YJ-9-1原生质体制备与再生的影响;采用DAPI染色和锁状联合缺失的观察,从再生株中筛选单核菌株并考察其产酶特性。结果表明：采用YGM菌丝生长培养基、88h菌龄、1h酶解时间、4,000r/min原生质体纯化离心速度以及YGMS再生培养基,最终可获得密度大约为5.0×106个/mL的原生质体悬浮液和9.1%的再生率;从200株再生菌株中筛选出了3株单核菌株,其中一株单核菌株D-2-1的漆酶产量比原菌T. hirsuta YJ-9-1明显提高,在第12天其漆酶酶活为771.67U/L,是原菌的1.51倍。     

荧光标记金针菇原生质体融合

以金针菇（Flmmulina velutipes）为材料,经异硫氨酸荧光素（FIC）标记的金针菇单核W19菌株的原生质体与未经标记的单核Y7菌株的原生质体在聚乙二醇（PEG）的诱导下进行融合,利用显微操纵仪直接挑取一个带有荧光而另一个不具荧光的原生质体对,培养后,根据融合形成的汉核菌丝具有“锁状连合”这一形态学特征选择、鉴定融合菌株,酯酶同工酶电泳分析结果表明,融合菌株具双亲互补酶带。经测定,多数融合菌株菌丝生长速度和生物量较亲株高,且出菇正常。     

产木质纤维素降解酶真菌的筛选及产酶特性

【背景】利用微生物处理秸秆引起研究者的广泛关注。【目的】筛选生长速度快、木质纤维素降解酶活性强的真菌菌株,用于植物秸秆降解和高效利用。【方法】从自然界采集的样品中分离纯化真菌菌株,利用PDA-愈创木酚和PDA-羧甲基纤维素钠平板初筛,再经过液体发酵检测漆酶酶活、羧甲基纤维素酶酶活及菌丝生长速率复筛目的菌株,通过内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)测序法对目的菌株进行鉴定,对目的菌株产漆酶和羧甲基纤维素酶活力进行测定及酶学性质研究。【结果】从样品中分离纯化到18株真菌,通过初筛筛选出9株产木质纤维素降解酶真菌菌株,再经过复筛,筛选出一株产漆酶、羧甲基纤维素酶活力高、菌丝生长快的菌株M1,经过分子生物学鉴定M1为糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus),其漆酶酶活为(243.59±1.11)U/mL,羧甲基纤维素酶酶活为(36.03±0.63) U/mL。在5 d的培养期内,菌丝生长速率为(9.43±0.32) mm/d。对菌株M1的发酵粗酶液的酶学性质进行了检测分析,结果表明,所产的漆酶在pH5.0-6.5相对酶活为90%以上,在pH ...     

金针菇子实体颜色的遗传规律研究

以金针菇黄色菌株F19和白色菌株F8801为亲本,原生质体单核化获得两亲本的单核菌株,配对杂交获得F1,从F1的子实体分离单孢菌株,与两亲本的原生质体单核化菌株进行回交配对,出菇观察子实体颜色,分析菇体颜色的遗传规律。研究结果表明,黄色为显性、白色为隐性,菇体颜色受一对基因(Cc)控制,与不亲和性因子A或B都没有连锁。     

金针菇担孢子核相及遗传属性的研究

以3个不同的金针菇菌株为材料,研究了其担孢子的核相及遗传属性。荧光染色观察显示,担孢子核相以双核为主,双核孢子、单核孢子和无核孢子分别占80.2%、7.5%和12.3%。源于单孢分离物的菌丝为有隔膜、无锁状联合的多核菌丝。在交配试验中,源于不同菌株单孢分离物的菌丝原生质体的配对形成具锁状联合的菌落,而源于同一单孢分离物的菌丝原生质体的配对则形成无锁状联合的菌落,暗示担孢子中的两个核具有相同的交配型。RAPD分析显示,源于同一单孢分离物的菌丝原生质体为10个随机引物所扩增的图谱彼此完全相同,印证了担孢子中的双核是同质的。此外,观察表明,一个担子上着生有4个担孢子。因此,金针菇是一种具4个含同质双核担孢子的四极性蕈菌。     

金针菇退化菌丝的生理生化特征

【背景】金针菇菌种在继代培养的过程中会出现菌种退化的现象,影响着金针菇的产量与质量。【目的】为研究金针菇退化菌种菌丝的生理生化特征,筛选金针菇退化菌株。【方法】以金针菇原始菌株(H)和退化菌株(T)为研究对象,测定不同碳源培养基上菌丝的生理生化特征及超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)的活性,并测定菌丝在栽培瓶中的漆酶(Laccase,Lac)和锰过氧化物酶(ManganesePeroxidase,MnP)的活性,记录菌丝在搔菌后的恢复情况。【结果】T在各个碳源的菌丝生长速度低于H,粉孢子等级在3-4级之间,SOD、CAT活性低于H,在栽培料中的Lac活性和MnP活性在第5天时与H相同,在第10、15、20天低于H。T在搔菌后菌丝恢复时间比H恢复时间长,恢复后的菌丝长势没有H长势浓密。【结论】通过探究金针菇原始菌株与退化菌株的菌丝生理生化特征,为判断金针菇菌株是否为退化菌株提供理论依据。     

火菇属野生菌株发酵液对栽培菌株的化感效应

为探究火菇属Flammulina野生菌株发酵液对栽培菌株的影响,以火菇属野生柳生金针菇F. rossica F52、野生金针菇F. filiformis F39和栽培金针菇F. filiformis F47为供试菌株,采用固体平板培养和液体发酵的方法,对比了添加不同体积分数火菇属野生菌株发酵液对栽培菌株平板中菌丝长速、液体发酵中菌丝生物量、干质量及漆酶和淀粉酶活力的影响。结果表明：不同体积分数野生金针菇菌株F39发酵液对栽培菌株F47菌丝长速有抑制作用,对发酵液中菌丝生物量无显著影响,当添加发酵液体积分数为50%时可显著提高菌株F47发酵液中漆酶活力,当体积分数为40%时,可显著提高菌株F47发酵液中淀粉酶的活力（P<0.05）;添加不同体积分数的野生柳生金针菇菌株F52发酵液对菌株F47除淀粉酶外其他指标均影响显著,添加体积分数为30%的发酵液对栽培金针菇F47菌丝长速具有显著的促进作用,当添加发酵液体积分数为40%时,对菌株F47液体发酵中菌丝干质量和漆酶活力均有显著促进作用（P<0.05）。证明了化感效应不仅存在于属间,在同属下的种间也存在。     

Transmission of Fusarium boothii mycovirus via protoplast fusion causes hypovirulence in other phytopathogenic fungi

There is increasing concern regarding the use of fungicides to control plant diseases, whereby interest has increased in the biological control of phytopathogenic fungi by the application of hypovirulent mycoviruses as a possible alternative to fungicides. Transmission of hypovirulence-associated double-stranded RNA (dsRNA) viruses between mycelia, however, is prevented by the vegetative incompatibility barrier that often exists between different species or strains of filamentous fungi. We determined whether protoplast fusion could be used to transmit FgV1-DK21 virus, which is associated with hypovirulence on F. boothii (formerly F. graminearum strain DK21), to F. graminearum, F. asiaticum, F. oxysporum f. sp. lycopersici, and Cryphonectria parasitica. Relative to virus-free strains, the FgV1-DK21 recipient strains had reduced growth rates, altered pigmentation, and reduced virulence. These results indicate that protoplast fusion can be used to introduce FgV1-DK21 dsRNA into other Fusarium species and into C. parasitica and that FgV1-DK21 can be used as a hypovirulence factor and thus as a biological control agent.     

产黄青霉ds RNA病毒通过原生质体融合的转移

将国内青霉素产生菌(Penicillium chrysogenum)的黄孢子系统及绿孢子(包括淡绿,灰绿)系统的十多个菌株,经过病毒提取、电镜观察、奥氏免疫双扩散、凝胶电泳及放射免疫测定,证明黄孢子系统的菌株含有不同滴定度的、直径40nm的球形病毒,而绿孢子系统中检查不出病毒。从营养要求、孢子颜色不同的带病毒和无病毒菌体中分离原生质体,进行不同组合的原生质体的融合杂交,获得营养互补融合的异核体。异核体1中,病毒通过胞质融合转移到原来无病毒的灰绿孢子菌株及细胞核融合后的杂合二倍体中。灰绿孢子的病毒量接近二倍体的1/3。二倍体菌落生长稳定,低温保存二年后经0.01—0.02M对氟苯丙氨酸(PFA)诱发和分离,产生亲本类型的分离子,分离子及二倍体仍然含有病毒。异核体2作亲本性分离,黄孢子仍有病毒,淡绿孢子及细胞核融合后产生的二倍体均无病毒,表明非感染性为显性。此种淡绿孢子的突变体中存在非感病菌系,它不支持病毒的复制。提取各杂交组二倍体内的病毒所特有的dsRNA时,可看出dsRNA的存在和病毒的存在一致。多数杂合二倍体的青霉素产量比亲本高。     

灵芝尿嘧啶营养缺陷型菌株的筛选和分子鉴定

【背景】营养缺陷型是一种应用广泛的分子标记,但是目前在灵芝中还未有研究和应用报道。【目的】为灵芝遗传转化研究、杂交育种和菌种鉴别提供亲本材料和技术支持。【方法】采用紫外光诱变、单单杂交、孢子单核化的方法从灵芝单核体菌株出发得到尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株。【结果】获得8株稳定的尿嘧啶营养缺陷型单核体突变菌株和7株尿嘧啶营养缺陷型双核体菌株。【结论】灵芝尿嘧啶营养缺陷型菌株在添加外源营养物的基础上可恢复正常生长,可以为灵芝遗传转化体系的构建和灵芝育种提供材料。     

河北省玉米小斑病菌玉米离蠕孢dsRNA病毒的检测及带毒菌株的生物学特征

玉米小斑病是我国玉米生产上的重要病害之一,每年造成玉米大幅减产。真菌病毒能够在真菌体内进行复制和繁殖,可以作为生物防治的潜在资源。为了明确河北省玉米小斑病菌玉米离蠕孢dsRNA病毒的多样性及生物学特性,为玉米小斑病的防控提供潜在生防资源,本研究采用单孢分离的方法分离纯化玉米小斑病菌150株,通过dsRNA提取及凝胶检测的方法检测带毒率,从分离的150株玉米离蠕孢中获得10株带有dsRNA病毒的菌株。通过电镜观察及RT-PCR方法验证发现5个菌株带有Bipolaris maydis partitivirus病毒。通过原生质体脱毒的方法获得无毒菌株后比较带毒菌株的生物学特性及胞外酶的分泌。结果发现Bipolaris maydis partitivirus病毒降低了玉米离蠕孢的生长速度和产孢量,显著降低其致病力及淀粉酶的分泌。本研究明确了河北省玉米离蠕孢dsRNA病毒的多样性,明确了携带Bipolaris maydispartitivirus病毒菌株的生物学特性,为玉米小斑病的防控提供了研究基础。     

Double-stranded RNA mycovirus from Fusarium graminearum

Double-stranded RNA (dsRNA) viruses in some fungi are associated with hypovirulence and have been used or proposed as biological control agents. We isolated 7.5-kb dsRNAs from 13 of 286 field strains of Fusarium graminearum isolated from maize in Korea. One of these strains, DK21, was examined in more detail. This strain had pronounced morphological changes, including reduction in mycelial growth, increased pigmentation, reduced virulence towards wheat, and decreased (60-fold) production of trichothecene mycotoxins. The presence or absence of the 7.5-kb dsRNA was correlated with the changes in pathogenicity and morphology. The dsRNA could be transferred to virus-free strains by hyphal fusion, and the recipient strain acquired the virus-associated phenotype of the donor strain. The dsRNA was transmitted to approximately 50% of the conidia, and only colonies resulting from conidia carrying the mycovirus had the virus-associated phenotype. Partial nucleotide sequences of the purified dsRNA identify an RNA-dependent RNA polymerase sequence and an ATP-dependent helicase that are closely related to those of Cryphonectria hypovirus and Barley yellow mosaic virus. Collectively, these results suggest that this dsRNA isolated from F. graminearum encodes traits for hypovirulence.     

Ligninolytic characteristics of Pleurotus ostreatus strain F6 and its monokaryotic protoplast derivative P19

A stable isolate of Pleurotus ostreatus P19 differing in some morphological and physiological characteristics from its parental wild-type strain F6 was obtained via protoplast isolation during the preparation of strains with altered ligninolytic abilities. The isolate is monokaryotic, does not form clamp-connections, and produces much higher activities of enzymes involved in lignin modification (laccase, manganese peroxidase). Cellulase activity was comparable to that of wild-type strain F6, but the xylanase activity was slightly higher in isolate P19. However, this monokaryotic derivative degrades lignin at a slightly lower rate than its parental strain F6. Electron microscopy observations of wood degradation as a function of mycelium growth were performed on three zones of birch wafers delimited according to the distance from the point of inoculation. The different stages of fungal mycelium growth showed differences in the ultrastructural patterns of the decay not only between the strains P19 and F6, but also depending on the distance from the point of inoculation. This suggests a spatio-temporally controlled secretion of enzymes along the hyphae. The enhanced ability of P19 to degrade the condensed forms of lignin in middle lamellae is correlated to its higher laccase activity.