Bacillus subtilis WHNB02植酸酶phyC基因的克隆及序列分析

采用PCR法获得产植酸酶芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WHNB02株植酸酶的全长phyc基因,并将其克隆到pUC18-T载体。序列分析表明该基因全长1152bp,编码一个383个氨基酸的多肽,信号肽切割位点位于第26个氨基酸残基之后。系统进化树表明,来源于7株芽孢杆菌的植酸酶在遗传上分为两大类。将Bacillus subtilis WHNB02植酸酶phyC基因序列及其氨基酸序列在GenBank中登录,登录号分别为AF220075和AA043434．1。     

中性植酸酶高产菌株的筛选及产酶条件研究

以地衣芽孢杆菌为原始出发菌株,用紫外线反复诱变,最终获得一株中性植酸酶高产菌株B.licheniformis LL8,其酶活性约为原始出发菌株的2倍。该菌株具有稳定的遗传性能。通过单因素试验和正交试验对发酵条件进行了优化,当培养温度为55℃,pH为7.5,接种量为10%时,经30h培养后,中性植酸酶活力最高达到2268.4U/mL。     

来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过ＰＣＲ的方法从Bacillus subtilis基因组中克隆了中性植酸酶基因nphy,ＤＮＡ全序列分析表明其结构基因全长１１５２个核苷酸（编码３８３个氨基酸）,５′端有一编码２６个氨基酸的信号肽序列。去除信号肽编码序列的nphy克隆到大肠杆菌ＩＰＴＧ诱导表达载体pTYB40上,在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的４０％以上,表达产物具有生物学活性,证实了克隆到的中性植酸酶的基因有正常的生物学功能。     

苏云金芽孢杆菌芽孢萌发相关基因gerM的克隆及功能研究

依照蜡状芽孢杆菌gerM基因的保守序列设计引物,从苏云金芽孢杆菌中扩增出640bp的DNA片段。以此为探针,从苏云金芽孢杆菌部分基因组酶切文库中成功地克隆到了一个4·5kb的DNA片段。序列分析表明,该片段包含一个完整的开放阅读框,其预测的编码产物与枯草芽孢杆菌GerM蛋白具有很高的同源性,将该基因命名为gerM。RT-PCR分析表明,gerM基因仅在芽孢形成的过程中表达。通过同源重组的策略构建了gerM基因的阻断突变株。研究表明,gerM基因的破坏影响苏云金芽孢杆菌芽孢萌发的速率和比例。     

短短小芽孢杆菌大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建

应用PCR技术从具有分泌蛋白能力强且没有胞外蛋白酶活性的短短小芽孢杆菌50中分离出细胞壁蛋白基因的多启动子和信号肽编码序列,利用它与质粒pUB110和pKF3-起构建成穿梭分泌表达载体pBKE50,将α0淀粉酶基因引入该载体转化短短小芽孢杆菌50后,发现α－淀粉酶可以活性形式分泌表达,此工作为下一步建立短短小芽孢杆菌高效分泌表达系统奠定了基础。     

细菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的诱导型异源表达

【目的】实现地衣芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效异源表达,并研究该重组酶的酶学性质。【方法】克隆巨大芽孢杆菌木糖异构酶基因的启动子区域及其调控蛋白,构建一个大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭型诱导表达质粒,使用该诱导型启动子介导麦芽糖淀粉酶编码基因,实现其在枯草芽孢杆菌中的功能表达。对重组枯草芽孢杆菌的诱导条件进行优化,提高麦芽糖淀粉酶的产量。【结果】获得了诱导表达麦芽糖淀粉酶基因的重组枯草芽孢杆菌菌株。最适诱导温度为45°C,最适诱导剂添加浓度为1%,最适添加诱导剂时间为接种培养9 h后。重组酶蛋白分子量大小为67 k D,对该酶的酶学性质研究发现,以可溶性淀粉为底物,反应生成麦芽糖和葡萄糖,其中麦芽糖含量为60.42%。重组酶最适作用温度为45°C,最适作用p H为6.5,Ca2+、Co2+、EDTA对该重组麦芽糖淀粉酶具有激活作用。【结论】通过木糖诱导表达系统可以实现麦芽糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效诱导型表达,酶活最高可达296.64 U/m L发酵液,在工业上有着较好的应用前景。     

中性蛋白酶基因诱导型表达分泌载体的构建

利用PCR方法分别扩增出sacB基因的启动子-信号肽序列（sacR）和枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的前肽-成熟肽序列,将两者连接后克隆入载体pHP13中,构建了含有中性蛋白酶基因的诱导型表达分泌载体pHP13SN,再将其转化入枯草杆菌DB104,获得基因工程菌DB104(pHP13SN)。中性蛋白酶基因在蔗糖的诱导和sacR的调控下实现了分泌表达,并获得了具有生物学活性的中性蛋白酶。     

巨大芽孢杆菌表达系统的特点及其研究进展

巨大芽孢杆菌表达系统是口前比较成功的异源蛋白原核分泌达系统,可能成为大肠杆菌表达系统的替代品,该文对该表达系统的特点及研究进展作一简要综述.该系统质具有胞外蛋白酶活性低,质粒稳定,可以直接将表达的蛋白高效分泌到培养基中,且无内毒素,诱导剂廉价和易培养等优点.至今已有多个基因在巨大芽孢杆菌中成功获得表达,这个系统被使用得越来越多.     

来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过PCR的方法从Bacillus subtilis基因组中克隆了中性植酸酶基因nphy,DNA全序列分析表明其结构基因全长1152个核苷酸(编码383个氨基酸),5′端有一编码26个氨基酸的信号肽序列。去除信号肽编码序列的nphy克隆到大肠杆菌IPTG诱导表达载体pTYB40上,在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量达到大肠杆菌可溶性蛋白的40%以上,表达产物具有生物学活性,证实了克隆到的中性植酸酶的编码基因有正常的生物学功能。     

枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因的克隆与表达

本研究对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的基因进行克隆,并在大肠杆菌中诱导表达。从枯草芽孢杆菌基因组克隆到编码中性蛋白酶的全长基因,构建大肠杆菌原核表达载体pET30b,转化大肠杆菌BL21得到重组工程菌。通过菌落PCR和酶切筛选验证重组体。在25℃,110 r/min条件下,用IPTG诱导重组蛋白表达。表达蛋白用SDS-PAGE验证,并对酶活力进行测定。测序结果表明克隆序列与NCBI上的登录的序列同源性高达99%。SDS-PAGE结果表明诱导出的蛋白相对分子质量56.6 kD,酶活力达到39 U/mL。证明成功克隆得到枯草芽孢杆菌中性蛋白酶基因,并在大肠杆菌中得到高效表达。